生长分化因子11对脂肪干细胞成脂分化及脂肪代谢的影响

发布时间：2023-04-05 00:42

　　目的:生长分化因子11(GDF11)作为一个新发现的生长分化因子,在胚胎发育以及抗衰老方面具有重要作用,但其对肥胖及肥胖相关性疾病的影响仍然未知。因此本研究通过构建CHO细胞GDF11表达系统,分离纯化获得GDF11蛋白,并进一步探究了其对脂肪干细胞增殖分化以及脂肪代谢的影响,为GDF11在肥胖及肥胖相关性疾病中的潜在应用提供理论依据。方法:1、利用基因工程技术构建pcDNA3.1⁺-KSH-DHFR-GDF11质粒。2、通过转染构建CHO细胞GDF11表达系统,并通过镍柱纯化系统分离纯化GDF11蛋白。3、利用CCK8法检测GDF11对脂肪干细胞增殖的影响,利用油红O染色和q-PCR检测GDF11对脂肪干细胞成脂分化的影响。4、利用油红O染色、甘油三酯检测、甘油检测等探究GDF11对脂肪代谢的影响。结果:1、通过菌落PCR、双酶切和测序证明成功构建了pcDNA3.1⁺-KSH-DHFR-GDF11质粒。2、通过SDS-PAGE电泳表明成功获得了GDF11蛋白。3、GDF11能促进脂肪干细胞的增殖,并抑制其成脂分化。4、GDF11抑制脂肪细胞...

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
英文缩写词
第一章 前言
    1 脂肪干细胞
    2 脂肪代谢
        2.1 ATGL：脂肪分解的初始步骤
        2.2 HSL：主要的DG脂肪酶
        2.3 MGL：脂肪分解的最后一步
        2.4 脂滴相关蛋白在脂解中的作用
    3 生长分化因子11(GDF11)
        3.1 GDF11的结构
        3.2 GDF11的表达和分布
        3.3 GDF11的信号通路
        3.4 GDF11的功能
            3.4.1 GDF11在肌肉组织发育中的作用
            3.4.2 GDF11在神经系统发育中的作用
            3.4.3 GDF11在消化腺发育中的作用
            3.4.4 GDF11在泌尿生殖系统发育中的作用
            3.4.5 GDF11在骨骼发育中的作用
            3.4.6 GDF11在抗衰老与心血管疾病中的作用
    4 研究意义
    5 技术路线
第二章 GDF11的表达及纯化
    1 引言
    2 实验材料
        2.1 实验菌株、细胞与质粒
        2.2 仪器与设备
        2.3 主要试剂
        2.4 本章所需核酸片段与引物序列
    3 主要试剂配方
    4 实验方法
        4.1 质粒提取
        4.2 感受态细菌的制备及转化
        4.3 PCR扩增目的片段
        4.4 琼脂糖核酸电泳
        4.5 胶回收
        4.6 目的片段和质粒的双酶切以及连接
        4.7 重组质粒的鉴定
        4.8 CHO细胞培养与转染
        4.9 转染子鉴定
        4.10 GDF11蛋白的表达鉴定与纯化
        4.11 GDF11活性鉴定
    5 实验结果
        5.1 pcDNA3.1⁺-KSH-DHFR重组质粒的构建
        5.2 pcDNA3.1⁺-KSH-DHFR-GDF11重组质粒的构建
        5.3 转染和筛选稳定的转染子以及GDF11蛋白的表达纯化
        5.4 GDF11蛋白活性鉴定
    6 讨论
第三章 GDF11对脂肪干细胞增殖和成脂分化的影响
    1 引言
    2 实验材料
        2.1 细胞
        2.2 仪器与设备
        2.3 主要试剂
        2.4 本章所涉及相关基因的引物
    3 主要试剂配方
    4 实验方法
        4.1 脂肪干细胞的分离提取
        4.2 脂肪干细胞鉴定
        4.3 细胞冻存
        4.4 细胞复苏与培养
        4.5 细胞传代或铺板
        4.6 脂肪干细胞增殖实验
        4.7 脂肪干细胞周期检测
        4.8 脂肪干细胞成脂分化
        4.9 油红O染色
        4.10 茜素红染色
        4.11 甲苯胺蓝染色
        4.12 RNA提取与q-PCR
        4.13 细胞总蛋白质的抽提
        4.14 蛋白质浓度的测定及调整
        4.15 Westernblotting
        4.16 统计分析
    5 实验结果
        5.1 脂肪干细胞的提取与鉴定
        5.2 GDF11对脂肪干细胞增殖的影响
        5.3 GDF11对脂肪干细胞中脂滴形成的影响
        5.4 GDF11对脂肪分化相关基因的影响
    6 讨论
第四章 GDF11对脂肪代谢的影响
    1 引言
    2 实验材料
        2.1 脂肪细胞
        2.2 实验仪器
        2.3 主要试剂
    3 实验方法
        3.1 油红O染色
        3.2 q-PCR
        3.3 Westernblotting
        3.4 甘油检测
        3.5 甘油三酯检测
        3.6 统计分析
    4 实验结果
        4.1 脂肪细胞
        4.2 GDF11减少脂肪细胞中甘油三酯的积累并促进脂肪分解
        4.3 GDF11对脂肪代谢相关基因或蛋白表达的影响
        4.4 GDF11通过PKA和BMP信号通路促进脂肪细胞中的脂肪分解代谢
    5 讨论
第五章 结论及展望
参考文献
附录
硕士期间主要成果
致谢



本文编号：3782376