四环素诱导大鼠靶向PPARγ基因沉默治疗糖皮质激素性骨质疏松症的实验研究

发布时间：2024-01-31 07:02

　　第一部分构建大鼠PPARy基因的tet-on慢病毒载体,体外实验确定载体对大鼠BMSCs成脂与成骨分化的影响目的分离、培养大鼠BMSCs。构建大鼠PPARy基因shRNA的Tet-on慢病毒载体,并转染大鼠BMSCs,在四环素的诱导下确定其沉默效应及对大鼠BMSCs成脂与成骨分化的影响。方法采用贴壁法分离培养大鼠BMSCs, SABC法进行鉴定。针对大鼠PPARγ基因特异序列,通过质粒重组、病毒包装及测序验证,构建pTRIPZ/PPARy-shRNA慢病毒载体,设空白对照组(Control组)、非特异性质粒转染组(shNTC)、慢病毒质粒转染组(shPPARγ)。分别转染大鼠BMSCs后,在四环素诱导下确定其沉默效应及最佳四环素诱导浓度。成脂诱导后RT-PCR检测成脂基因C/EBPα ADD1 mRNA的表达,Western blotting检测C/EBPα ADD1蛋白的表达,油红O染色检测其成脂细胞分化。成骨诱导后RT-PCR检测成骨基因collagenI和Cbfa1/Runx2的表达,Western blotting检测collagen I和Cbfa1/Runx2蛋白的表达,通过...

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【学位级别】：博士

【部分图文】：

图１－２?ｐＲｓｖ－ＲＥＶ巧粒图谱??

ｐＴＲＪＰＺ?（Ｔｒａｎｓｆｅｒ?Ｖｅｃｔｏｒ）。其中Ｔｒａｎｓｆｅｒ?Ｖｅｃｔｏｒ含有能表这红色焚光蛋白??（加＇ｂｏＲＦＰ）?；?Ｐ民ｓｖ－ＲＥＶ，ｐＭＤｌｇ－ｐ民ＲＥ，ｐＭＤ２Ｇ含有病毒包装所必须的元件??（见图１－１？图１－４）。??ＶＥＣＴＯＲ?ＭＡＰ?麵??Ｏｔｈｅ＊....

图１－５大鼠ＢＭＳＣｓ原代培养第８天形态学观察（Ｘ２００）??

刚剛接种的大鼠ＢＭＳＣｓ悬浮于培养基内，２４ｈ后贴壁生成，成纺锥形，随着??逐次换液逐渐去除未贴壁的细胞，而贴壁的纺链形细胞越米越多，同时混有一些??杂细胞（见图１－５），１２－１４ｄ细胞开始传代，经过３次传代，细胞逐渐纯化，形??态均＾，＾集落样生长（见图１－６）。??ＳＡＢＣ....

图１－６大鼠ＢＭＳＣｓ?Ｐ３代形态学观察（Ｘ２００）??

３．２．１?ｐＳＭ２－ＰＰＡＲｙ设病奉载体构建沖间载体）??将ｐＳＭ２载体及ＰＵＣ５７－ＰＰＡＲＹ质粒使用Ｘｈｏ?Ｉ和ＥｃｏＲ?Ｉ进行酶切，产物加??样到１％的琼脂糖胶进行电泳鉴定，结果显示酶切正确（见图１－８）。??３６??

图１－１０），重组质粒测??

华中科技大学博击学位论文??ａ調??準??图１－６大鼠ＢＭＳＣｓ?Ｐ３代形态学观察（Ｘ２００）??ＣＤ４４＋?ＣＤ５４＋?？?Ｃｆｂ７１＋，，??＼?？?？?ｒ?，濤??、－、?＇ｖ?＾?§＇?Ｊ＊??言＇?准?；＃：？＞？＊?／??ＣＤ３４－?＾０４５－＊＇?？’??為?＇＃?....

本文编号：3891175