游离脂肪酸通过GPR40/GPR120抑制KLF15表达的作用及机制研究

发布时间：2024-03-02 04:30

　　目的本研究在收集正常体重及肥胖个体网膜脂肪组织,以及构建饮食诱导肥胖小鼠模型的基础上,明确受试个体血糖、血脂等一般资料以及网膜脂肪组织G蛋白偶联受体120(G Protein Coupled Receptor 120,GPR120)、G蛋白偶联受体40(G Protein Coupled Receptor 40,GPR40)与Krüppel样因子15(Krüppel-Like Factor 15,KLF15)表达之间的相关性;在体外培养小鼠脂肪细胞的基础上,观察游离脂肪酸(Free Fatty Acid,FFA)是否通过上调/激活GPR120/GPR40/p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)信号通路抑制脂肪细胞KLF15的表达,继而导致脂肪细胞糖代谢紊乱。通过以上研究,明确FFA对KLF15表达的影响,并探讨其可能的分子机制,为临床寻找治疗肥胖、胰岛素抵抗、炎症及相关代谢疾病新靶点提供实验依据和理论基础。方法(1)以体质指数(Body Mass Index,BMI)为标准,将受试个体分为正常体重组(Nor...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
中英文缩略词对照表
前言
实验材料
    1.1 组织标本来源
    1.2 细胞系
    1.3 相关试剂及仪器
        1.3.1 试剂和耗材
        1.3.2 仪器
    1.4 引物序列表
实验方法
    2.1 正常及肥胖个体样本采集
    2.2 肥胖小鼠模型建立及标本采集
    2.3 3T3-L1 细胞的培养和诱导分化
        2.3.1 细胞传代
        2.3.2 细胞冻存
        2.3.3 细胞复苏
        2.3.4 诱导液的配制和脂肪细胞诱导分化
        2.3.5 油红O染色鉴定
    2.4 PA和 OA的配制
        2.4.1 PA和 OA的配制
        2.4.2 0.1 mol/L氢氧化钠溶液的配制
        2.4.3 30 %BSA溶液配制
        2.4.4 40 mM PA的配制
        2.4.5 40 mM OA的配制
        2.4.6 PA和 OA混合液的配制
    2.5 拮抗剂的配制和使用
        2.5.1 AH7614 的配制和使用
        2.5.2 GW1100 的配制和使用
        2.5.3 SB203580 的配置和使用
    2.6 组织和细胞系的RNA提取
        2.6.1 组织样本
        2.6.2 细胞样本
        2.6.3 提取过程
    2.7 cDNA合成及逆转录
    2.8 Real-time PCR
    2.9 组织和细胞系的蛋白提取
        2.9.1 组织样本
        2.9.2 细胞样本
    2.10 DNA/RNA和蛋白浓度测定(超微量分光光度计)
        2.10.1 仪器的校准
        2.10.2 核酸样本检测
        2.10.3 蛋白样本检测
    2.11 免疫印迹试验
    2.12 生化指标检测
    2.13 统计方法
结果
    一、人体组织实验
        1.1 受试个体一般资料及血糖血脂水平比较
        1.2 受试个体网膜脂肪组织KLF15的m RNA和蛋白表达水平比较
        1.3 受试个体网膜脂肪组织KLF15的m RNA表达水平与一般资料和生化指标的相关性分析
    二、动物实验
        2.1 构建肥胖小鼠模型
        2.2 小鼠内脏脂肪组织KLF15 和相关因子m RNA表达的差异比较
        2.3 内脏脂肪组织KLF15的m RNA表达水平与一般资料、生化指标和相关因子的相关性分析
        2.4 阻断GPR120 后,HFD小鼠脂肪组织中KLF15 的表达
        2.5 阻断GPR40 后,HFD小鼠脂肪组织中KLF15 的表达
    三、体外细胞实验
        3.1 3T3-L1 前脂肪细胞的培养及诱导分化
        3.2 棕榈酸(Palmitic Acid,PA)和油酸(Oleic Acid,OA)混合液对脂肪细胞GPR120、GPR40、KLF15 表达以及p38 MAPK磷酸化的影响
            3.2.1 不同浓度PA和 OA混合液刺激脂肪细胞,检测KLF15、GPR120和GPR40 的表达水平、p38 MAPK磷酸化水平以及上清液葡萄糖含量
            3.2.2 PA和 OA混合液刺激脂肪细胞同时阻断GPR120,检测KLF15 的表达和上清液葡萄糖含量
            3.2.3 PA和 OA混合液刺激脂肪细胞同时阻断GPR40,检测KLF15 的表达和上清液葡萄糖含量
            3.2.4 PA和 OA混合液刺激脂肪细胞同时阻断p38 MAPK磷酸化,检测KLF15 的表达
        3.3 PA对脂肪细胞GPR120、GPR40、KLF15 表达以及p38 MAPK磷酸化的影响
            3.3.1 不同浓度PA刺激脂肪细胞,检测KLF15、GPR120和GPR40 的表达水平、p38 MAPK磷酸化水平以及上清液葡萄糖含量
            3.3.2 1500 μM PA刺激脂肪细胞同时阻断GPR120,检测KLF15 的表达水平、p38 MAPK磷酸化水平以及上清液葡萄糖含量
            3.3.3 1500 μM PA刺激脂肪细胞同时阻断GPR40,检测KLF15 的表达水平、p38 MAPK磷酸化水平
            3.3.4 1500 μM PA刺激脂肪细胞同时阻断p38 MAPK磷酸化,检测KLF15 及相关因子表达水平
        3.4 OA对脂肪细胞GPR120、GPR40、KLF15 表达以及p38 MAPK磷酸化的影响
            3.4.1 不同浓度OA刺激脂肪细胞,检测KLF15、GPR120和GPR40 的表达水平、p38 MAPK磷酸化水平以及上清液葡萄糖含量
            3.4.2 750 μM OA刺激脂肪细胞同时阻断GPR120,检测KLF15 的表达水平、p38 MAPK磷酸化水平以及上清液葡萄糖含量
            3.4.3 750 μM OA刺激脂肪细胞同时阻断GPR40,检测KLF15 的表达水平、p38 MAPK磷酸化水平以及上清液葡萄糖含量
讨论
结论
参考文献
综述
    参考文献
致谢
作者简介
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本文编号：3916339