miR-206通过调控TIMP3影响RA-FLS迁移及侵袭的研究

发布时间：2024-06-11 19:15

　　研究背景与目的:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜增生为特征的慢性自身免疫性疾病。病理特征为炎症细胞浸润、滑膜组织增生以及血管翳的形成,进而导致软骨及骨质破坏,最终导致关节功能障碍。RA成纤维样滑膜细胞(Rheumatoid arthritis Fibroblast-like synoviocyte,RA-FLS)是滑膜组织的主要成分,在炎性因子的刺激下,RA-FLS异常活化,具有异常的迁移、侵袭等一些类似于肿瘤细胞样的特性。在关节软骨和骨侵蚀中发挥关键作用。基质金属蛋白酶组织抑制剂(Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases,TIMPs)是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的天然抑制剂。TIMP3是TIMPs家族中唯一几乎能抑制全部MMPs的抑制剂。小分子非编码RNA已成为包括自身免疫性疾病在内的多种疾病的可能生物标志物,参与细胞增殖、凋亡、分化、血管生成和免疫应答等过程的调控。miR-206属于MyomiRs家族,近年来研究表明,miR-206能调控肿瘤细胞的迁移...

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
中英文缩略词对照表
前言
1. 主要实验材料
    1.1 试剂耗材
    1.2 实验仪器及设备
    1.3 常用配方
2. 主要实验方法
    2.1 细胞培养技术
        2.1.1 原代RA-FLS的制备与培养
        2.1.2 细胞培养
        2.1.3 细胞鉴定
        2.1.4 细胞冻存
        2.1.5 细胞复苏
    2.2 腺病毒感染细胞
    2.3 慢病毒的构建
        2.3.1 转化
        2.3.2 挑克隆、摇菌
        2.3.3 质粒的提取
        2.3.4 质粒的电泳
        2.3.5 慢病毒包装实验
    2.4 慢病毒感染细胞
    2.5 RT-qPCR
        2.5.1 总RNA提取(全程冰上操作)
        2.5.2 反转录
        2.5.3 qPCR检测TIMP3的mRNA水平
        2.5.4 加尾反转录
        2.5.5 miRNA的qPCR检测
    2.6 Western Blot实验
        2.6.1 总蛋白提取(冰上操作)
        2.6.2 蛋白定量
        2.6.3 SDS-PAGE电泳
    2.7 细胞划痕实验
    2.8 Transwell细胞迁移实验
    2.9 Transwell侵袭实验
    2.10 双荧光素酶报告基因实验
        2.10.1 psiCHECK-2-TIMP3'UTR-WT质粒的构建
        2.10.2 重组质粒psi-check-2/TIMP3 3'UTR突变型质粒的构建
        2.10.3 双荧光素酶报告基因实验
    2.11 统计学处理
3 实验结果
    3.1 MH7A细胞及RA-FLS细胞的鉴定结果
    3.2 TIMP3对RA-FLS迁移与侵袭的影响
        3.2.1 构建过表达TIMP3的RA-FLS细胞模型
        3.2.2 过表达TIMP3抑制RA-FLS的迁移及侵袭
    3.3 miR-206对RA-FLS迁移与侵袭的影响
        3.3.1 构建过表达miR-206的RA-FLS细胞模型
        3.3.2 过表达miR-206促进RA-FLS迁移与侵袭
        3.3.3 构建抑制表达miR-206的RA-FLS细胞模型
        3.3.4 抑制miR-206的表达能抑制RA-FLS迁移及侵袭
    3.4 miR-206负调控RA-FLS中TIMP3的表达
    3.5 miR-206靶向调控TIMP3
        3.5.1 psiCHECK-2 TIMP3 3'UTR-WT重组载体构建成功
        3.5.2 psiCHECK-2/TIMP3突变型质粒构建成功
        3.5.3 TIMP3是miR-206直接调控的靶基因
4 讨论
5 结论
参考文献
文献综述
    参考文献
致谢
攻读学位期间发表的论文及获得的奖励



本文编号：3992587