短肽FLPNF增强自噬对INS-1细胞hIAPP聚集的影响及其分子机制的实验研究

发布时间：2024-07-08 23:04

　　目的:糖尿病是严重威胁人类健康的重大慢性疾病之一。根据最新报道,我国成年人糖尿病的患病率为10.9%,是世界上糖尿病病人最多的国家。在所有糖尿病病人中,2型糖尿病约占90-95%。尽管在过去的20年中,国内外学者对2型糖尿病进行了大量的研究工作,但其具体的病理生理机制仍不十分清楚。目前认为其发生发展因素可分为以下三类:(1)遗传易感因素;(2)胰岛淀粉样多肽(islet amyloid polypeptide,IAPP)所致的细胞毒性;(3)与生活和饮食方式相关的风险因素等。2型糖尿病病人以胰岛β细胞功能障碍和数量显著减少、胰岛素抵抗及胰岛淀粉样蛋白沉积形成为主要病理生理学特征。其中,人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide,hIAPP)是胰岛淀粉样蛋白沉积的主要成分。越来越多的研究表明,hIAPP诱导的胰岛β细胞功能障碍和细胞凋亡增加在糖尿病的发生发展过程中具有重要作用。因此,预防和减少hIAPP沉积可减少胰岛β细胞凋亡、改善胰岛β细胞的胰岛素分泌功能。自噬-溶酶体系统是细胞降解错误折叠蛋白和受损细胞器的主要途径之一。目前研究认为自噬-溶酶体系...

【文章页数】：113 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分 :短肽FLPNF增强hIAPP-INS-1 细胞自噬流的实验研究
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 材料与试剂
            2.1.1 细胞
            2.1.2 主要试剂与耗材
            2.1.3 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞培养
            2.2.2 短肽的合成与准备
            2.2.3 Western Blot检测TAT-FLPNF、FLPNF对 INS-1 细胞LC3 表达的影响
            2.2.4 CCK-8 检测TAT-FLPNF对 INS-1 细胞活力的影响
            2.2.4 过表达hIAPP的 hIAPP-INS-1 细胞的构建
            2.2.6 Western Blot检测不同浓度TAT-FLPNF对 hIAPP-INS-1 细胞LC3 表达的影响
            2.2.7 Western Blot检测TAT-FLPNF对hIAPP-INS-1 细胞LC3、P62 表达的影响
            2.2.8 透射电子显微镜检测TAT-FLPNF对 hIAPP-INS-1 细胞自噬体数量的影响
            2.2.9 表达m RFP-GFP-LC3的hIAPP-INS-1 细胞的构建
            2.2.10 激光共聚焦显微镜检测hIAPP-INS-1 细胞内自噬流情况
            2.2.11 统计学分析
    3 结果
        3.1 短肽TAT-FLPNF可进一步增加INS-1 细胞LC3-II/LC3-I比值
        3.2 短肽TAT-FLPNF不影响INS-1 细胞活力
        3.3 短肽TAT-FLPNF增加细胞LC3-II/LC3-I比值的最佳浓度为200μM
        3.4 短肽TAT-FLPNF增加LC3-II/LC3-I比值可被自噬抑制剂3-MA阻断
        3.5 短肽TAT-FLPNF显著增加细胞自噬体数量
        3.6 短肽TAT-FLPNF促进细胞自噬体的形成
        3.7 短肽TAT-FLPNF增强细胞自噬流
    4 讨论
    5 结论
第二部分 :短肽FLPNF增强hIAPP-INS-1 细胞自噬流的分子机制研究
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1
            2.1.1 细胞
            2.1.2 主要试剂与耗材
            2.1.3 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞培养
            2.2.2 短肽的合成与准备
            2.2.3 过表达hIAPP的 hIAPP-INS-1 细胞的构建
            2.2.4 表达myr-Akt的 HEK-293-myr-Akt细胞的构建
            2.2.5 过表达Flag-labeled mTOR的 HEK-293 细胞的构建
            2.2.6 Western Blot检测TAT-FLPNF对 hIAPP-INS-1 细胞p70S6K及 S6 磷酸化水平的影响
            2.2.7 Western Blot检测TAT-FLPNF对 HEK-293-myr-Akt细胞GSK3β及S6磷酸化水平的影响
            2.2.8 Western Blot检测TAT-FLPNF对 hIAPP-INS-1 细胞Akt、p70S6K及S6磷酸化水平的影响
            2.2.9 流式细胞仪检测Anti-Flag免疫磁珠上的FITC信号强度
            2.2.10 Autodock Vina软件预测短肽FLPNF与 FRB结构域的结合情况
            2.2.11 统计学分析
    3 结果
        3.1 短肽TAT-FLPNF抑制PI3K-Akt-mTOR-p70S6K信号通路
        3.2 短肽TAT-FLPNF抑制mTOR活性
        3.3 短肽TAT-FLPNF抑制mTORC1 活性,但不影响mTORC2 活性
        3.4 短肽FLPNF与 FRB结构域结合
    4 讨论
    5 结论
第三部分 :短肽FLPNF减少hIAPP寡聚体沉积、保护hIAPP-INS-1 细胞的实验研究
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1
            2.1.1 细胞
            2.1.2 主要试剂与耗材
            2.1.3 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞培养
            2.2.2 短肽的合成与准备
            2.2.3 过表达hIAPP的 hIAPP-INS-1 细胞的构建
            2.2.4 过表达r IAPP的 r IAPP-INS-1 细胞的构建
            2.2.5 寡聚体抗体A11 检测短肽TAT-FLPNF对 hIAPP寡聚体沉积的影响
            2.2.6 CCK-8 检测TAT-FLPNF对 hIAPP-INS-1 细胞活力的影响
            2.2.7 Western Blot检测TAT-FLPNF对 hIAPP-INS-1细胞CleavedCaspase-3 表达的影响
            2.2.8 ELISA检测TAT-FLPNF对 hIAPP-INS-1 细胞GSIS功能的影响
            2.2.9 统计学分析
    3 结果
        3.1 短肽TAT-FLPNF减少hIAPP-INS-1 细胞内hIAPP寡聚体沉积
        3.2 短肽TAT-FLPNF提高hIAPP-INS-1 细胞活力
        3.3 短肽TAT-FLPNF降低hIAPP-INS-1 细胞Cleaved Caspase-3 水平
        3.4 短肽TAT-FLPNF改善hIAPP-INS-1 细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌能力
    4 讨论
    5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历



本文编号：4004010