晚期糖基化终末产物处理的成纤维细胞中TGF-β1通过Egr-1调控细胞外基质生成

发布时间：2017-06-16 14:09

  本文关键词：晚期糖基化终末产物处理的成纤维细胞中TGF-β1通过Egr-1调控细胞外基质生成，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景糖尿病足溃疡(Diabetes foot ulceration)糖尿病(Diabetes mellitus)常见且严重的并发症之一。目前,糖尿病足溃疡的治疗主要手段是创面换药及护理、下肢大血管重建及外科清创及截肢手术,然而,这些治疗手段并未取得很好的效果,因此,研究糖尿病足溃疡的病理过程及寻找其难愈的机制,寻找新的治疗手段,是当今医学界的热点及难点。创面愈合是一个复杂的过程,其中涉及多种细胞类型、细胞外基质的分泌功能、各种生长因子及细胞素的相互作用。皮肤成纤维细胞(Dermal fibroblast),是皮肤组织中的主要细胞成分,是创面愈合过程中重要细胞,调控着大量在创面愈合中复杂及必需的过程,如分泌多种生长因子及细胞素,分泌细胞外基质(extracellular matrix, ECM)及创面组织重建。成纤维细胞在创面愈合过程中经过迁移、分化、增殖,分泌大量纤维粘连蛋白(fibronectin, FN)及Ⅰ型胶原(collagen I, Col-1),与创面新生的毛细血管共同形成肉芽组织,填补组织缺陷,为表皮生长提供了条件。生长转化因子-β1 (Transforming growth factor-β1, TGF-β1)在创面愈合中有着举足轻重的地位,在创面愈合的早期,TGF-β1释放增加,促使了各种炎症细胞进入创面,在这个过渡阶段,肉芽组织逐渐形成,TGF-β1促进了细胞外基质的分泌,主要包括FN及Col-1。同时,TGF-β1可以促进成纤维细胞的迁移、分化、增殖,强烈趋化成纤维细胞,加速新生血管形成但抑制上皮细胞生长,刺激成纤维细胞合成ECM。TGF-β1可诱导成纤维细胞转化为以α-SMA为表型特征的肌成纤维细胞(Myofibroblast),后者在促进肉芽组织形成及创面收缩过程起重要作用。晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products, AGEs)与糖尿病足溃疡的发生发展过程有着重要的关系,可抑制成纤维细胞迁移、转化及合成纤维粘连蛋白及各类胶原的能力,在糖尿病患者体内成纤维细胞细胞膜上RAGE持续高表达,可引起成纤维细胞损伤和功能损害。早期生长反应因子-1 (Early growth response factor-1, Egr-1),属于即刻早期基因(immediate early gene)家族成员之一,随着研究的不断深入,发现Egr-1在创面愈合过程发挥着重要的作用。在正常的皮肤成纤维细胞中,Egr-1的变化影响了超过600个基因的表达,涉及细胞分化、迁移、细胞外基质的沉积、创面愈合、新生血管形成。此外,研究证实了Egr-1有促进新生血管形成及增加胶原纤维合成的作用,具有加速创面愈合的生物学效应。Egr-1作为即刻早期基因家族中的一员,在创面愈合过程中起着重要调控作用。相关研究指出,TGF-β1可诱导皮肤成纤维细胞中Egr-1的表达,与此同时,也能诱导细胞外基质(ECM)的分泌。但在糖尿病病理状态下,TGF-β1诱导人源原代皮肤成纤维细胞中Egr-1是如何变化的,目前缺少相关研究。AGEs延缓了糖尿病足溃疡的创面愈合,目前大多数集中于动物研究,缺少相关分子生物学证据,糖尿病病理状态下,成纤维细胞分泌细胞外基质的功能是否受损,仍需要进一步证实。在皮肤成纤维细胞中,Egr-1是否作为关键基因,参与调控细胞外基质的分泌,也需进一步证实。本研究以人源原代皮肤成纤维细胞为研究对象,探讨TGF-β1在正常条件下及AGEs存在条件下诱导其表达Egr-1、FN及Co1-1的情况,再使用了针对Egr-1的siRNA及Egr-1过表达质粒进行实验初步推测Egr-1与细胞外基质FN、Col-1之间的关系。最后,通过收集糖尿病足溃疡创面组织及正常对照皮肤组织,检测在Egr-1、FN、Col-1 mRNA及蛋白的表达是否存在差异。第一章TGF-β1在AGEs条件下诱导成纤维细胞表达Egr-1及细胞外基质的特征目的探讨TGF-β1在正常条件下及AGEs存在条件下诱导其表达Egr-1、FN及Col-1的情况,初步推测Egr-1与细胞外基质FN、Col-1之间的关系。方法1.细胞培养：采用正常完全培养基(含25mmol/LD-葡萄糖,15%胎牛血清,1%青霉素链霉素混合液),于37℃、5%C02细胞培养箱中培养人源原代皮肤成纤维细胞,所有用于实验研究的对象均为3-10代细胞。2.配制AGEs:取BSA溶液20ml,D-葡萄糖溶液6.36ml,青霉素溶液480μl,庆大霉素溶液204μl混合,0.22μm滤器过滤,置于37℃培养箱避光孵育90天,4℃透析24h以去除未结合的葡萄糖。以相同方法制备未加入D-葡萄糖的的非糖化BSA作为对照。3.细胞分组：对照组(control)、TGF-β1组(TGF-β1:加入10ng/ml TGF-β1)、 TGF-β1联合100ug/ml AGEs组(TGF-β1+A100:10ng/ml TGF-β1+100ug/ml AGEs)、TGF-β1联合200ug/ml AGEs组(TGF-β1+A200:10ng/ml TGF-β1+200ug/ml AGEs)、TGF-β1联合300ug/ml AGEs组(TGF-β1+A300: 10ng/ml TGF-β1+300ug/ml AGEs)、检测Egr-1时按时间点分组(Omin,15min, 30min,60min,120min 及 360min:加入10ng/ml TGF-β1后刺激的时间)、300ug/ml AGEs组检测Egr-1( AGEs:300ug/ml AGEs刺激适当时间)、TGF-β1联合300ug/ml AGEs 组检测 Egr-1 (TGF-β1+AGEs:10ng/ml TGF-β1+300ug/ml AGEs刺激适当时间)。4.使用正常完全培养基培养成纤维细胞后,加入10ng/ml浓度的TGF-β1刺激24小时后,提取总蛋白及总RNA,使用实时荧光定量PCR及免疫印迹试验,检测α-SMA mRNA及蛋白表达情况。5.使用正常完全培养基培养成纤维细胞后,加入TGF-β1 (10ng/ml)刺激后,同时使用不同浓度的AGEs (100、200、300ug/ml),培养24小时,提取总RNA及总蛋白,使用实时荧光定量PCR及免疫印迹试验,检测FN及Col-1 mRNA及蛋白表达情况。6.使用正常完全培养基培养成纤维细胞后,加入TGF-β1 (10ng/ml)刺激,在0min,15min,30min,60min,120min及360min分别收集细胞,提取总RNA及总蛋白,检测Egr-1 mRNA及蛋白表达情况。7.使用正常完全培养基培养成纤维细胞后,在加入TGF-β1 (10ng/ml)刺激时,同时加入300ug/ml的AGEs,适当时间后收集细胞提取总RNA及总蛋白,检测Egr-1 mRNA及蛋白表达情况。8.统计学分析：实验数据均采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,各组计量资料均采用均数±标准差(mean±SD)表示。多组间均数的比较采用单向方差分析(One-way ANOVA),组间多重比较均使用LSD法；如果组间方差不齐,组间多重比较均使用Dunnett's T3法。所得P值小于0.05认为差异有统计学意义。结果1.TGF-β1对皮肤成纤维细胞α-SMA mRNA及蛋白表达的影响：TGF-β1刺激24小时后,qRT-PCR检测α-SMA mRNA表达较对照组明显升高,差异具有统计学意义(P0.05),Western blot检测蛋白表达显示同样结果,差异具有统计学意义(P0.05)。2.在不同浓度的AGEs影响下,TGF-β1对皮肤成纤维细胞FN及Col-1 mRNA及蛋白表达的影响：TGF-β1刺激24小时后,FN及Col-1 mRNA及蛋白表达量较对照组明显升高,差异有统计学意义(P0.05),但在加入不同浓度的AGEs后,FN及Co1-1表达较TGF-β1刺激组呈下降趋势,尤其以300ug/ml浓度明显,差异具有统计学意义(P0.05)。故后续实验使用AGEs作用浓度为300ug/ml。3.TGF-β1诱导皮肤成纤维细胞Egr-1 mRNA及蛋白表达的特点：加入β1TGF-后,随着时间延长,15min Egr-1 mRNA表达开始升高,30min时升至最高,约为空白组的15倍差异有统计学意义(P0.05)。随后开始逐渐下降,360min时降至与空白对照组同一水平。后续实验需要检测Egr-1 mRNA表达水平,选用加入TGF-β1后30min作为实验时间点。加入TGF-β1后,Egr-1蛋白表达水平随着时间延长逐渐升高,在120min时表达水平是对照组的1.6倍左右,差异具有统计学意义(P0.05),随后表达开始下降。后续实验需要检测Egr-1蛋白表达水平,选用加入TGF-β1后120min作为实验时间点。4.在300ug/ml的AGEs作用下,TGF-β1诱导皮肤成纤维细胞Egr-1 mRNA及蛋白表达的特点：加入TGF-β1刺激30min后,Egr-1 mRNA表达较对照组明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。AGEs组较对照组无明显变化,差异无统计学意义(P0.05)。加入TGF-β1刺激时同时加入300ug/ml的AGEs,Egr-1 mRNA的表达明显低于TGF-β1刺激组,差异有统计学意义(P0.05)。Western blot结果显示：加入TGF-β1刺激120min后,Egr-1蛋白表达水平较对照组升高约1.8倍,单加AGEs刺激组较对照组无明显差异,加入TGF-β1刺激时同时加入300ug/ml的AGEs, Egr-1蛋白表达量较TGF-β1刺激组明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。结论1.TGF-β1诱导了以α-SMA为标志物的成纤维细胞表型转换,此表型转换过程在创面愈合过程中起着关键作用。2.在AGEs影响下,TGF-β1诱导成纤维细胞分泌细胞外基质能力受损。3.通过qPCR及Western blot检测方法,得出了人源皮肤原代成纤维细胞Egr-1的表达特点,加入TGF-β1刺激后30mmin为mRNA表达最高的时间点,120min为蛋白表达最高的时间点。4.300ug/ml的AGEs与TGF-β1共同作用于成纤维细胞,Egr-1 mRNA及蛋白的表达明显低于TGF-β1刺激组,首次阐述了在成纤维细胞中,Egr-1在AGEs影响下的表达特点。5.Egr-1在TGF-β1刺激及TGF-β1联合AGEs刺激下,与细胞外基质FN、Co1-1的表达呈现一致性。第二章TGF-β1诱导成纤维细胞表达的Egr-1与细胞外基质之间的关系目的明确Egr-1与FN、Col-1之间的联系,初步探讨其中的上下游关系。方法1.细胞培养：同第一章。2.实验分组：空白组(blank)、脂质体组(mock)、阴性对照组(Negative control, NC)、阴性对照联合TGF-β1组(NC+TGF-β1)、Egr-1-homo-1624联合TGF-β1组(si1624+TGF-β1)、Egr-1-homo-749联合TGF-β1组(si749+TGF-β1)、 Egr-1-homo-1508联合TGF-β1组(si1508+TGF-β1)、Egr-1-homo-353联合TGF-β组(si3531TGF-β1)、空载体组(pENTER)、过表达组(pENTER-Egr-1)、空载体联合TGF-β1组(pENTER+TGF-β1)、过表达联合TGF-β1组(pENTER-Egr-1+ TGF-β1).3.分别转染NC, si1624, si749, si1508, si353后,加入10ng/ml TGF-β1刺激30分钟后,收集细胞,提取总RNA进行qPCR检测Egr-1。转染NC, si1624,si749后,加入10ng/ml TGF-β1刺激120分钟后,收集细胞,提取总蛋白进行Western blot检测Egr-1表达水平。4.成纤维细胞经si1624, si749转染后,加入10ng/ml TGF-β1刺激24小时,收集细胞,提取总RNA及总蛋白进行检测FN及Co1-1。5.进行质粒DNA的转染,提取总RNA及总蛋白观察Egr-1的表达变化。6.使用10ng/ml TGF-β1刺激经质粒DNA转染的成纤维细胞24小时,收集细胞提取总RNA及总蛋白检测FN及Co1-1。7.统计学分析：同第一章。结果1.TGF-β1诱导siRNA转染后的成纤维细胞Egr-1 mRNA及蛋白的表达特点：blank、mock组与NC组之间无明显差异,NC组加入10ng/ml TGF-β1刺激后,Egr-1 mRNA及蛋白表达明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。转染了si1624, si749的细胞,加入lOng/ml TGF-β1刺激后,Egr-1 mRNA及蛋白表达均低于NC+TGF-β1组,差异具有统计学意义(P0.05)。2.TGF-β1诱导siRNA转染后的成纤维细胞FN、Col-1 mRNA及蛋白的表达特点：blan、mock、NC三组间FN、Col-1 mRNA及蛋白表达未见明显差异,加入10ng/ml TGF-β1刺激24小时后,FN、Col-1 mRNA及蛋白表达量较NC组明显上升,差异具有统计学意义(P0.05)。经si 1624, si749转染后的两个组别的细胞,加入10ng/ml TGF-β1刺激后,mRNA及蛋白表达量较对照组并无明显变化,但明显低于NC+TGF-β1表达量差异具有统计学意义(P0.05)。3.质粒DNA转染后的成纤维细胞Egr-1 mRNA及蛋白的表达特点：通过空载体及过表达质粒的转染24小时后,过表达组Egr-1 mRNA及蛋白的表达均较空载体组明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。4.TGF-β1诱导质粒转染后的成纤维细胞FN、Col-1 mRNA及蛋白的表达特点：经pENTER-Egr-1过表达质粒转染组FN、Col-1 mRNA及蛋白的表达量均较空载组明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。同时,空载组加入10ng/ml TGF-β1刺激后,FN及Col-1 mRNA及蛋白的表达量与过表达组相似,同样明显高于空载组(P0.05)。过表达组中加入10ng/ml TGF-β1刺激后,FN、Col-1 mRNA及蛋白表达高于空载组(P0.05)。结论在皮肤成纤维细胞中,TGF-β1通过Egr-1,进而促进了细胞外基质FN、Col-1的表达。Egr-1在成纤维细胞分泌细胞外基质的过程中起重要的上游调节作用。第三章Egr-1、FN及Col-1在糖尿病足溃疡患者创面组织中的表达特点目的初步探讨Egr-1、FN、Col-1在糖尿病足溃疡创面组织与正常对照间的表达差异。方法1.收取南方医科大学南方医院内分泌代谢科2014年2月至2014年3月住院的糖尿病足溃疡患者创缘组织(7例)及正常健康对照皮肤组织(5例),通过qPCR及Western blot检测Egr-1、FN及Co1-1的表达水平。2.统计学分析：非正态分布资料采用中位数(范围)描述,余同第一章。结果正常对照组中,Egr-1、FN、Col-1 mRNA及蛋白的表达均明显高于糖尿病足溃疡组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论首次报道了糖尿病足溃疡组织Egr-1、FN、Col-1的表达均明显低于正常对照组。Egr-1与细胞外基质的变化呈一致性。
【关键词】：糖尿病足溃疡 早期生长反应因子-1 晚期糖基化终末产物 皮肤成纤维细胞 细胞外基质
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-21
• 前言21-28
• 第一章 TGF-β1在AGEs条件下诱导成纤维细胞表达Egr-1及细胞外基质的特征28-58
• 第一节 实验材料28-36
• 第二节 实验方法与步骤36-46
• 第三节 实验结果46-55
• 第四节 讨论55-58
• 第二章 TGF-β1诱导成纤维细胞表达的Egr-1与细胞外基质之间的关系58-74
• 第一节 实验材料58-60
• 第二节 实验方法与步骤60-62
• 第三节 实验结果62-72
• 第四节 讨论72-74
• 第三章 Egr-1、FN及Col-1在糖尿病足溃疡患者创面组织中的表达特点74-80
• 第一节 实验对象74-75
• 第二节 材料与方法75-76
• 第三节 实验结果76-78
• 第四节 讨论78-80
• 全文小结80-81
• 参考文献81-85
• 附录85-87
• 攻读学位期间成果87-88
• 致谢88-89

【参考文献】

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1 李欣蔚;张勇;;整联蛋白及其信号转导途径对骨骼肌生长发育的调控[J];动物营养学报;2012年07期

  本文关键词：晚期糖基化终末产物处理的成纤维细胞中TGF-β1通过Egr-1调控细胞外基质生成，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：455586