MICU1下调介导的线粒体钙摄取障碍在糖尿病心肌病发生中的作用及机制

发布时间：2017-07-16 18:24

  本文关键词：MICU1下调介导的线粒体钙摄取障碍在糖尿病心肌病发生中的作用及机制

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【摘要】：【研究背景】糖尿病是以代谢紊乱为主要特征的一种慢性疾病,其发病率呈逐年上升的趋势,严重威胁人类的健康。糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病主要的心血管并发症之一,更是糖尿病心血管病患者预后不良的重要原因。DCM主要以心肌左室收缩和(或)舒张功能障碍为特征,若治疗不当,会导致心律失常、心源性休克、心力衰竭,严重者甚至发生猝死。因此,对糖尿病心肌病的发病机制及防治措施的研究意义重大。线粒体钙稳态失衡导致的线粒体功能紊乱被认为是糖尿病心肌病发生的重要病理机制。但是,糖尿病状态下心肌线粒体钙摄取降低的具体分子机制至今仍不清楚。近年来陆续有多篇关于细胞线粒体钙摄取机制的研究原著发表在Nature、Cell、Cell Metabolism等高水平杂志上,鉴定出线粒体钙离子单向转运蛋白(MCU,mitochondrial calcium uniporter)、线粒体钙离子摄入蛋白1(MICU1,mitochondrial calcium uptake1)等调控线粒体钙摄取的关键分子。MCU定位在线粒体内膜形成孔道,而MICU1具有两个典型的EF手形结构域,该结构可感知钙离子的变化,可能作为MCU正向调节蛋白发挥作用。有意思的是,研究发现MICU1功能丧失导致的线粒体钙紊乱参与儿童特定类型的大脑疾病和肌肉疾病发生,提示MICU1功能受损与线粒体相关疾病存在密切关系。然而,MICU1是否参与了糖尿病心肌线粒体钙稳态调控,进而影响糖尿病心肌病的发生?国内外尚未见报道。因此,本研究旨在阐明MICU1在糖尿病心肌病中所发挥的作用,并深入探讨其具体机制,期望为临床治疗糖尿病心肌病提供新的思路。【研究目的】1)明确MICU1在糖尿病心肌病中的表达变化及在糖尿病心肌病发展中的作用。2)探讨MICU1调控糖尿病心肌病发生的分子机制。3)初步探讨MICU1在糖尿病小鼠心脏中表达下调的机制。【研究方法】1.MICU1在糖尿病心肌病中的表达变化及在糖尿病心肌病发展中的作用。采用不同周龄db/db糖尿病小鼠和对照组小鼠,通过免疫印迹实验、实时定量PCR及免疫组化方法对MICU1的表达进行检测。利用心肌点注射腺病毒上调MICU1的表达水平。体式荧光显微镜验证腺病毒心肌点注射效果同时评估心脏体积大小,并采用免疫印记方法对MICU1的表达进一步检测。通过小动物超声检测小鼠心脏功能,利用免疫印记方法及实时定量PCR方法检测MICU1及其相关分子的表达水平,免疫组化方法检测其表达及定位。通过心脏重量、心重/胫骨长度比、心肌横截面积(CSA)及α-MHC、β-MHC、ANF的m RNA表达检测小鼠心肌肥厚。制作冰冻切片,利用mito SOX染色检测心肌组织水平ROS的变化。采用免疫印记方法检测心肌细胞凋亡相关蛋白caspase3及caspase9的蛋白表达。2.MICU1下调促进糖尿病心肌细胞凋亡的机制研究。在H9C2心肌细胞中,使用高糖高脂培养(33mmol/L葡萄糖+0.5mmol/L棕榈酸钠)24h,利用腺病毒及si RNA干涉分别上调及下调MICU1的表达水平后,通过免疫印迹实验检测心肌细胞凋亡相关蛋白caspase3、caspase9及Cyto-c的蛋白表达,运用流式细胞术对免疫印记实验结果进行进一步的验证。通过TMRM染色检测心肌细胞膜电位的改变,在利用线粒体靶向小清蛋白清除线粒体钙的基础上,利用线粒体钙染料Rhod-2对心肌细胞线粒体钙摄取能力进行检测,利用mito SOX染色检测心肌细胞水平ROS的改变。利用PDH活性试剂盒,α-KGDH活性检测试剂盒,NAD+/NADH检测试剂盒,NADP+/NADPH检测试剂盒及GSH/GSSG检测试剂盒检测心肌细胞抗氧化能力。3 MICU1在糖尿病小鼠心脏中表达降低的机制。利用生物信息学方法对MICU1的表达调控进行了初步预测。利用CHIP实验对预测结果进一步验证,并在细胞水平分别上调和下调SP1的表达后检测MICU1的表达水平,并检测db/db糖尿病小鼠心肌组织SP1的表达,同时利用GSE数据库中的芯片数据分析SP1与MICU1的相关性。【研究结果】1.周龄为6周的db/db糖尿病小鼠心肌组织中MICU1表达无显著改变,饲养至12周时,MICU1的表达水平显著低于对照组,且随着周龄的增大表达逐渐降低。上调MICU1的表达可显著抑制心肌组织ROS的生成,减轻心肌细胞凋亡,显著增强心脏收缩功能,提高α-MHC的表达表达水平,同时降低β-MHC及ANF的表达水平,减小心肌横截面积,抑制心肌细胞肥大,从而显著延缓糖尿病心肌病的发展。2.高糖高脂培养H9C2心肌细胞系24h后可显著下调MICU1的表达。下调MICU1的表达会显著降低线粒体钙摄取能力,降低心肌细胞线粒体膜电位,增加ROS的生成,促进心肌细胞凋亡。反之,上调MICU1可提高线粒体钙摄取能力,提高心肌细胞线粒体膜电位,抑制心肌细胞线粒体ROS的生成进而抑制心肌细胞凋亡。3.生物信息学分析预测MICU1的转录调控因子为SP1。CHIP实验发现在MICU1第一个外显子前1个碱基的位置,SP1与MICU1发生特异性结合。在细胞水平分别上调和下调SP1的表达后发现MICU1的表达随SP1的改变而改变,通过检测db/db糖尿病小鼠心肌组织SP1的表达发现在6周龄时表达无变化,饲养至12周时SP1的表达较对照组出现显著降低,且随周龄增长表达逐渐下降,与MICU1在db/db糖尿病小鼠心肌中的表达趋势相一致,同时利用GSE数据库中的芯片分析发现SP1与MICU1的表达呈正相关。【结论】1.发现MICU1在糖尿病心肌中表达降低,并随着糖尿病心肌病加重其表达进一步下降。在db/db糖尿病小鼠心肌中上调MICU1的表达可显著降低心肌细胞横截面积,减轻心脏重量及降低心重/胫骨长度比值,从而显著延缓糖尿病心肌病心肌肥厚的发展。同时上调MICU1的表达可抑制心肌组织ROS生成,降低心肌细胞的凋亡。2.MICU1可通过增强线粒体钙摄取能力抑制心肌细胞线粒体ROS的生成进而减轻高糖高脂引起的心肌细胞凋亡。3.糖尿病心肌MICU1的表达受转录因子SP1的调控。
【关键词】：糖尿病心肌病 MICU1 线粒体 细胞凋亡
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-12
• ABSTRACT12-16
• 前言16-17
• 文献回顾17-28
• 第一部分 MICU1在糖尿病心肌病中的作用28-50
• 1 材料28-30
• 1.1 实验动物及细胞28
• 1.2 主要试剂28-29
• 1.3 主要仪器29-30
• 2 方法30-42
• 2.1 动物实验实施方案30
• 2.2 心脏石蜡切片制备30-31
• 2.3 心肌组织免疫组化检测MICU1的表达及定位31-33
• 2.4 构建心肌点注射腺病毒过表达MICU1小鼠模型33-34
• 2.5 体式荧光显微镜观察腺病毒荧光表达34
• 2.6 小动物超声检测心脏功能34
• 2.7 心脏重量及心重/胫骨长度34
• 2.8 体式荧光显微镜观察观察心肌大体样本34-35
• 2.9 心脏冰冻切片制备35
• 2.10 心肌组织麦胚凝集素染色检测心肌细胞横截面积35
• 2.11 心肌组织Mito SOX?染色检测心肌细胞线粒体ROS的生成35-36
• 2.12 Western blot检测心肌组织MICU1、caspase3及caspase9的蛋白表达水平36-39
• 2.13 实时定量PCR检测不同周龄心肌组织MICU1及 α-MHC、β-MHC、ANF的m RNA表达水平39-41
• 2.14 统计学分析41-42
• 3 结果42-48
• 3.1 糖尿病小鼠心肌组织MICU1的表达下调42-43
• 3.2 心肌点注射腺病毒模型成功构建43-44
• 3.3 MICU1改善糖尿病心肌病的心脏功能44
• 3.4 MICU1抑制糖尿病心肌肥厚，减缓糖尿病心肌病的发展44-47
• 3.5 MICU1抑制线粒体ROS生成，，减少心肌细胞凋亡47-48
• 4 讨论48-50
• 第二部分 MICU1下调促进糖尿病心肌细胞凋亡的机制研究50-71
• 1 材料50-52
• 1.1 实验动物及细胞50
• 1.2 主要试剂50-51
• 1.3 主要仪器51-52
• 2 方法52-62
• 2.1 细胞实验分组52-54
• 2.2 细胞培养所需液体的配制54
• 2.3 H9C2心肌细胞系的培养、传代、冻存及复苏54-55
• 2.4 腺病毒感染H9C2心肌细胞系55-56
• 2.5 si RNA转染实验56-57
• 2.6 Western Blot检测心肌细胞MICU1、PV、caspase3、caspase9和Cyto-c的蛋白表达水平57-58
• 2.7 流式细胞术检测心肌细胞凋亡58-59
• 2.8 TMRM检测心肌细胞膜电位59
• 2.9 Rhod-2 检测心肌细胞线粒体钙静态及钙瞬变59-60
• 2.10 Mito SOX~(?)染色检测心肌细胞线粒体ROS的生成60
• 2.11 PDH活性检测试剂盒检测心肌细胞PDH活性60-61
• 2.12 α-KGDH活性检测试剂盒检测心肌细胞PDH活性61
• 2.13 NAD~+/NADH及NADP~+/NADPH在心肌细胞中的检测61
• 2.14 心肌细胞GSH/GSSG的检测61-62
• 2.15 统计学分析62
• 3 结果62-68
• 3.1 下调MICU1促进心肌细胞凋亡62-63
• 3.2 上调MICU1抑制心肌细胞凋亡63-64
• 3.3 MICU1通过促进线粒体钙摄取抑制ROS，减轻高糖高脂诱导的心肌细胞凋亡64-66
• 3.4 MICU1介导的线粒体钙摄取通过提高线粒体抗氧化能力抑制ROS生成66-67
• 3.5 MICU1通过MCU促进线粒体钙摄取抑制心肌细胞凋亡67-68
• 4 讨论68-71
• 第三部分 MICU1在糖尿病小鼠心脏中表达降低的机制71-81
• 1 材料71-73
• 1.1 实验动物及细胞71
• 1.2 主要试剂71-72
• 1.3 主要仪器72-73
• 2 方法73-78
• 2.1 MICU1启动子序列分析73
• 2.2 染色质免疫共沉淀（Ch IP）73-76
• 2.3 细胞实验实施方案76-77
• 2.4 Western Blot检测MICU1和SP1的蛋白表达水平77
• 2.5 实时定量PCR检测心肌组织MICU1及SP1的m RNA表达水平77
• 2.6 利用基因芯片分析SP1与MICU1的相关性77
• 2.7 统计学分析77-78
• 3 结果78-80
• 3.1 SP1直接转录调节MICU1的表达78-79
• 3.2 组织水平MICU1的表达与SP1呈正相关79-80
• 4 讨论80-81
• 小结81-82
• 参考文献82-92
• 个人简历和研究成果92-93
• 致谢93

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