SND1在肝细胞中影响胰岛素受体信号通路的研究

发布时间：2017-07-17 04:14

  本文关键词：SND1在肝细胞中影响胰岛素受体信号通路的研究

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【摘要】：目的:2型糖尿病是世界范围内最为严重的代谢疾病之一,其发病基础是胰岛β细胞分泌胰岛素的功能障碍和外周组织的胰岛素抵抗。研究表明主要的分子机制之一是肝、肌肉、脂肪等胰岛素靶器官的胰岛素受体信号受损,引起胰岛素抵抗进而导致糖尿病的发生。SND1是一种广泛存在的多功能蛋白,具有高度的保守性。近期研究表明SND1蛋白可以与PPARγ直接结合,并在脂肪细胞中特异性的结合到PPARγ靶基因的PPRE区,作为转录共激活因子调控脂肪细胞的分化。高脂饮食处理后,SND1过表达小鼠体内可以看到肝脏脂肪变性的减轻及胰岛素敏感性的提高。上述结果提示SND1蛋白参与了脂肪和肝脏的胰岛素抵抗过程,可以影响肝和脂肪等胰岛素敏感组织对Insulin刺激的反应。本课题在已有研究结果的基础上探讨SND1在肝细胞中对胰岛素受体信号通路的影响,并探讨可能的分子机制。方法:本课题以HepG2细胞和小鼠原代肝细胞为研究模型,研究SND1在肝细胞中的作用。通过对SND1敲低(Knock Down,KD)和转入空载(Control,Ctrl)的HepG2细胞进行棕榈酸盐(Palmitate,Palm)刺激模拟高脂刺激条件,油红O染色观察两种细胞的脂质积累进而确定SND1对肝细胞脂肪积累的影响;对HepG2 KD和Ctrl细胞,以及提取的SND1过表达小鼠(Transgenosis,Tg)和野生型小鼠(Wlid Type,WT)的原代肝细胞进行Palm处理24h后给予短时相的胰岛素刺激,Western-Blot检测胰岛素受体β(Insulin Receptor,IRβ)、p-Akt等胰岛素信号通路关键分子的表达水平来确定SND1对高脂刺激后肝细胞胰岛素信号通路的作用;通过放线菌酮(Cycloheximide,CHX)和蛋白酶体抑制剂MG132处理HepG2 KD和Ctrl细胞,在长时间Insulin刺激后观察IRβ的变化,进而分析SND1影响胰岛素受体含量的机制;采用实时定量PCR(RT-PCR)检测SND1基因、Insr和Smurf1基因的表达情况,并采用Co-IP实验验证SND1与IRβ、E3泛素连接酶Smurf1的蛋白结合等实验研究SND1介导IRβ泛素化降解的具体机制,结果:1.SND1可以减少高脂状态下肝细胞的脂质积累,无论在小鼠原代肝细胞还是人肝癌细胞系HepG2中,SND1蛋白都体现出提高细胞内p-IRS1、p-Akt水平,提高肝细胞的胰岛素敏感性。2.对肝细胞进行长时间的高脂刺激可以加速IRβ的降解,这一过程需要SND1的参与。3.CHX和MG132的相关实验证实了SND1是通过泛素-蛋白酶体途径影响IRβ的降解。4.HACT类的E3泛素连接酶Smurf1与SND1的蛋白表达和mRNA水平在不同刺激时都保持一致,但是其不与SND1结合。IRβ与SND1的Co-IP实验也显示SND1不与IRβ结合,但Smurf1可以结合IRβ。结论:1.SND1可以提升高脂状态下肝细胞的胰岛素敏感性,并减轻肝细胞的脂质堆积。2.SND1蛋白可以通过使胰岛素受体β发生泛素-蛋白酶降解从而影响胰岛素信号通路,高水平的SND1可以增强肝细胞内p-IRS1、p-Akt水平,进而提高肝细胞的胰岛素敏感性。3.SND1的mRNA和蛋白表达水平都与Smurf1一致,但不能与Smurf1和IRβ通过蛋白结合作用调控IRβ的泛素化降解。
【关键词】：SND1蛋白 胰岛素受体 泛素化降解 胰岛素抵抗
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 符号说明10-12
• 前言12-17
• 研究现状、成果12-16
• 研究目的、方法16-17
• 一、SND1 对肝细胞成脂和 IR 信号通路的影响17-37
• 1.1 对象和方法18-29
• 1.1.1 研究模型18
• 1.1.2 主要试剂18-19
• 1.1.3 主要溶液、缓冲液19-22
• 1.1.4 主要仪器、设备22-23
• 1.1.5 实验方法和流程23-29
• 1.2 结果29-34
• 1.3 讨论34-36
• 1.4 小结36-37
• 二、SND1 通过泛素-蛋白酶体途径介导 IR 降解37-50
• 2.1 对象和方法38-42
• 2.1.1 研究用细胞38
• 2.1.2 主要试剂38
• 2.1.3 主要溶液、缓冲液与培养基38
• 2.1.4 主要仪器、设备38
• 2.1.5 实验方法与流程38-42
• 2.2 结果42-47
• 2.3 讨论47-49
• 2.4 小结49-50
• 全文结论50-51
• 课题展望51-52
• 参考文献52-60
• 发表论文和参加科研情况说明60-61
• 综述 胰岛素受体信号影响胰岛素抵抗的研究进展61-76
• 综述参考文献67-76
• 致谢76-77
• 个人简历77

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本文编号：551926