骨质疏松症脂肪干细胞Wnt信号通路相关差异基因筛选的实验研究

发布时间：2017-07-18 05:24

  本文关键词：骨质疏松症脂肪干细胞Wnt信号通路相关差异基因筛选的实验研究

  更多相关文章： Wnt信号通路 DKK-1 LiCl 骨质疏松脂肪干细胞

【摘要】：第一部分:骨质疏松小鼠模型建立及骨质疏松小鼠脂肪干细胞的分离培养鉴定目的:骨质疏松病(Osteoporosis)的发病机制在于骨重建过程中成骨活动下降,破骨活动上升,导致骨代谢平衡被破坏,骨组织吸收大于形成。最终导致密质骨变薄,骨小梁密度减低,骨质疏松,骨折发生几率增加,骨愈合能力降低[1]。脂肪干细胞来源丰富,易于获取,以往对于脂肪干细胞的研究已证实该细胞具有骨向分化的潜能[2],而骨质疏松脂肪干细胞是否具有同样的成骨能力尚未见报道。本实验通过建立小鼠骨质疏松模型,分离培养建模成功的骨质疏松小鼠脂肪干细胞(OP-ASCs)。为研究骨质疏松症脂肪干细胞Wnt信号通路相关差异基因筛选的实验提供细胞支持。方法:(1)将雌性C57BL/6小鼠随机分为实验组(去势组)和对照组(假手术组)。去势组取10周龄小鼠(体重18~20克),切除双侧卵巢。术后4 w、8w,从去势组和假手术组随机选取6只小鼠,麻醉后,采用micro-CT测定股骨中间骨干的骨体积分数(bone volume fraction,BV/TV,%),通过对照上述指标从影像学角度证明骨质疏松小鼠造模成功。再从去势组和假手术组中随机选取6只小鼠,取其膝关节进行切片及HE、MASSON染色,通过观察其骨小梁密度、骨密质厚度判断造模成功与否。(2)颈椎脱法处死小鼠,75%酒精浸泡小鼠进行全身消毒,取上述骨质疏松小鼠腹股沟脂肪组织,使用组织块法将小鼠脂肪组织剪碎,翻转干涸,于含10%FBSα-MEM培养基中进行小鼠OP-ASCs原代培养,酶消化法进行细胞传代,传代至第二代时,得出所需骨质疏松小鼠脂肪干细胞。(3)所得骨质疏松小鼠脂肪干细胞进行流式细胞学检测,证明其干细胞特性。结果:从影像学及组织学方面证明去势法构建骨质疏松小鼠模型成功,通过流式细胞学检测骨质疏松小鼠脂肪干细胞,发现其干细胞表面抗体为阳性,符合干细胞特性,证明组织块法自骨质疏松小鼠腹股沟脂肪取得的细胞确为骨质疏松小鼠脂肪干细胞。结论:通过去势法我们成功建立了骨质疏松小鼠动物模型,自取得的骨质疏松小鼠腹股沟取得OP-ASCs。第二部分骨质疏松小鼠脂肪干细胞中Wnt信号通路的变化情况目的:以往研究证实Wnt信号通路在骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、正常的脂肪干细胞的骨向分化中起着至关重要的作用[3-5],但在OP-ASCs中,Wnt信号通路是否与在其他种类的干细胞中一样扮演着重要的角色,并且如果Wnt信号通路在OP-ASCs中同样扮演着调控成骨的作用,其骨向分化的调控的具体分子机制尚待进一步研究。本研究目的在于通过上调及下调Wnt信号通路,筛选出Wnt信号通路中基因差异性表达出的关键因子,从而与现有研究的其他干细胞中的Wnt信号通路的关键因子变化进行比较,并探究Wnt信号通路对OP-ASCs骨向分化的调控的具体分子机制,为骨质疏松脂肪干细胞修复骨缺损等临床应用提供实验依据。方法:将小鼠重组DKK-1蛋白按照0.1μg/ml加入含10%FBSα-MEM培养基,LiCl以50mg/ml加入含10%FBSα-MEM培养基,将骨质疏松小鼠脂肪干细胞分为LiCl处理组、DKK-1处理组,并设置用10%FBSα-MEM培养基的对照组,在第一天、第三天两个时间点提取细胞的总RNA,以Wnt信号通路PCR芯片结合Real-time PCR筛选出其中的Wnt信号通路有关的差异性基因。结果:第一天时,LiCl组小鼠OP-ASCs与对照组相比,Ccnd1基因表达上调,Porcn、Sfrp 1、Sfrp 2、Sfrp 4、Wnt 5a基因表达降低,而DKK-1组小鼠OP-ASCs与对照组相比,Axin 1、Fzd 6、Wnt 5a基因表达上调。第三天时,LiCl组小鼠OP-ASCs与对照组相比,Wnt 2基因表达水平上调,Nlk、Porcn、Wnt 5a基因表达水平下调;DKK-1组小鼠OP-ASCs与对照组相比,Wif1、Wnt5a基因表达水平上调。结论:1.在OP-ASCs中,经典Wnt信号通路同样在调控这些基因的表达,我们推测LiCl的加入上调了OP-ASCs中激活经典Wnt信号通路的Wnt 2基因表达,下调了抑制经典Wnt信号通路的Porcn、Sfrp 1、Sfrp 2、Sfrp 4基因,激活了经典Wnt信号通路,从而使其下游基因Ccnd1表达上调;而DKK-1的加入上调了经典Wnt信号通路抑制剂Axin 1、Wif1基因,从而抑制了经典Wnt信号通路。2.LiCl的加入下调了非经典Wnt信号通路的关键因子Wnt 5a、Nlk基因表达,从而抑制了非经典Wnt信号通路,而DKK-1的加入上调了非经典Wnt信号通路的关键因子Wnt 5a、Fzd6基因表达,从而激活了非经典Wnt信号通路。
【关键词】：Wnt信号通路 DKK-1 LiCl 骨质疏松脂肪干细胞
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R580
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-12
• 前言12-16
• 第一部分 骨质疏松小鼠模型建立及骨质疏松小鼠脂肪干细胞的分离培养鉴定16-30
• 材料与方法17-21
• 结果21-25
• 讨论25-29
• 结论29-30
• 第二部分 PCR基因芯片检测骨质疏松小鼠脂肪干细胞中Wnt信号通路的变化情况30-49
• 材料及方法31-37
• 结果37-43
• 讨论43-48
• 结论48-49
• 参考文献49-55
• 英汉缩略词对照表55-56
• 致谢56-57
• PPARγ 和Wnt信号通路调节干细胞成骨或成脂分化（综述）57-85
• 参考文献69-85
• 附件85-88

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本文编号：556189