外源性钙对氟致小鼠成骨细胞增殖及Wnt信号通路的影响

发布时间：2017-07-25 14:45

  本文关键词：外源性钙对氟致小鼠成骨细胞增殖及Wnt信号通路的影响

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【摘要】：[目的]通过检测Wnt通路抑制剂和不同水平钙对氟中毒小鼠成骨细胞增殖过程中Wnt信号通路相关基因和蛋白表达水平的变化,探究氟致小鼠成骨细胞增殖的作用机理以及适当剂量的钙对氟中毒的缓解作用,为有效防治氟中毒提供理论依据。[方法]取出生24h内的小鼠颅骨,采用阶段性酶消化法分离纯化培养细胞,经HE、吉姆萨、碱性磷酸酶和钙化结节染色鉴定为成骨细胞后,进行成骨细胞的传代,取第三代生长状况良好的小鼠成骨细胞随机分为7组。每组进行如下处理：对照组(C)用正常DMEM完全培养液培养,攻氟组(F)分别添加10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L浓度的氟化钠,氟加抑制剂组(F+Y)添加10-6mol/L的氟化钠和5μg/mL的Wnt通路抑制剂DKK1,抑制剂组(Y)添加5μg/mL的DKK1,氟加低钙组(F+Cal)在攻氟组培养液中添加1mmol/L的氯化钙,氟加中钙组(F+Call)在攻氟组培养液中添加2mmol/L的氯化钙,氟加高钙组(F+Calll)在攻氟组培养液中添加4mmol/L的氯化钙。试验周期为24h。使用MTT法检测成骨细胞增殖情况,使用real-time PCR技术检测成骨细胞Wnt信号通路相关基因的表达水平,使用细胞免疫荧光、激光共聚焦、Western blotting技术检测成骨细胞Wnt信号通路相关蛋白的表达水平。[结果]1.本试验采用酶消化法成功从小鼠颅骨中分离出细胞并培养,利用HE、吉姆萨、碱性磷酸酶、茜素红多种染色法鉴定所培养细胞为成骨细胞。2.10-8、10-7、10-6mol/L的氟对小鼠成骨细胞增殖有显著促进作用,10-5mol/L的氟对小鼠成骨细胞增殖的促进作用不显著,10-4mol/L的氟对小鼠成骨细胞增殖有抑制作用。3.体外培养小鼠成骨细胞24h时,氟对其增殖率影响最显著。4.Wnt通路抑制剂明显抑制了氟致小鼠成骨细胞的增殖。5.10-6mol/L的氟能够促进小鼠成骨细胞中Wnt3a、β-Catenin、C-myc基因mRNA水平的表达,添加2mmol/L的钙有效抑制了氟致小鼠成骨细胞增殖相关基因的表达。6.10-6mol/L的氟能够促进小鼠成骨细胞中β-Catenin、Wnt3a、C-myc和CyclinD1蛋白的表达,抑制GSK3β蛋白的表达,添加2mmol/L的钙有效抑制了氟致小鼠成骨细胞增殖相关蛋白的表达。[结论]10-6mol/L的氟通过激活Wnt信号通路促进小鼠成骨细胞增殖,补充2mmol/L的钙能有效缓解氟对成骨细胞的毒性作用。
【关键词】：氟 钙 成骨细胞 增殖 Wnt通路
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R595;R68
【目录】：

• 摘要7-9
• 文献综述9-12
• 前言12-13
• 第一章 体外小鼠成骨细胞的培养和鉴定13-23
• 1 材料与方法13-16
• 1.1 试验材料13-14
• 1.2 试验方法14-16
• 1.3 数据统计16
• 2 试验结果16-20
• 2.1 小鼠成骨细胞的原代培养16-17
• 2.2 小鼠成骨细胞的传代培养17
• 2.3 小鼠成骨细胞的鉴定17-18
• 2.4 不同氟浓度对体外培养小鼠成骨细胞增殖的影响18-19
• 2.5 Wnt通路抑制剂(DKK1)对体外培养氟致小鼠成骨细胞增殖率的影响19-20
• 3 讨论与分析20-22
• 3.1 小鼠成骨细胞的原代分离及其传代培养20-21
• 3.2 小鼠成骨细胞的鉴定21
• 3.3 不同氟浓度对体外培养小鼠成骨细胞增殖的影响21-22
• 3.4 DKK1对体外培养氟致小鼠成骨细胞增殖率的影响22
• 4 小结22-23
• 第二章 不同剂量钙对氟致小鼠成骨细胞增殖Wnt通路相关基因的影响23-33
• 1 材料与方法23-28
• 1.1 试验材料23-24
• 1.2 试验方法24-27
• 1.3 数据统计27-28
• 2 试验结果28-30
• 2.1 RNA的完整性和纯度28
• 2.2 不同剂量钙和DKK1对氟致小鼠成骨细胞增殖基因表达的影响28-30
• 3 讨论与分析30-32
• 4 小结32-33
• 第三章 不同剂量钙对氟致小鼠成骨细胞增殖Wnt通路相关蛋白的影响33-44
• 1 材料与方法33-38
• 1.1 试验材料33-35
• 1.2 试验方法35-38
• 1.3 数据统计38
• 2 试验结果38-42
• 2.1 激光共聚焦检测氟致小鼠成骨细胞增殖β-Catenin蛋白表达的影响38-39
• 2.2 免疫荧光检测不同剂量钙和DKK1对小鼠成骨细胞增殖Wnt3a蛋白表达的影响39-40
• 2.3 免疫荧光检测不同剂量钙和DKK1对小鼠成骨细胞增殖CyclinD1蛋白表达的影响40
• 2.4 Western blotting检测不同剂量钙和DKK1对氟致小鼠成骨细胞增殖GSK3β蛋白表达量的影响40-41
• 2.5 Western blotting检测不同剂量钙和DKK1对氟致小鼠成骨细胞增殖C-myc蛋白表达量的影响41
• 2.6 Western blotting检测不同剂量钙和DKK1对氟致小鼠成骨细胞增殖β-Catenin蛋白表达量的影响41-42
• 3 讨论与分析42-43
• 4 小结43-44
• 全文结论44-45
• 参考文献45-51
• Abstract51-53
• 致谢53

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本文编号：571759