FTZ含药血清改善氧化应激引起的INS-1胰岛β细胞损伤的作用及机制探究

发布时间：2017-07-26 21:29

  本文关键词：FTZ含药血清改善氧化应激引起的INS-1胰岛β细胞损伤的作用及机制探究

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【摘要】：研究背景:糖尿病是一组由于胰岛素抵抗及(或)胰岛素分泌缺陷引起的以高血糖为特征的代谢性疾病,已成为当前威胁人类健康的最重要的非传染性疾病之一。持续高血糖对胰岛β细胞的损伤在2型糖尿病发生、发展过程中所起的作用越来越受关注。高血糖引起的氧化应激是导致胰岛β细胞损伤的主要原因之一。本实验室前期研究表明,复方贞术调脂胶囊(Fu fang Zhen shu Tiao zhi Capsule,FTZ)具有降糖、降脂、抗凝、抗炎、保护血管内皮细胞等作用,能同时干预脂质的吸收、合成、转化、转运、分解、排泄等多个环节,对动脉粥样硬化、高脂血症、非酒精性脂肪肝等代谢性疾病具有很好的防治作用。但FTZ是否具有改善氧化应激引起的胰岛β细胞损伤、维持胰岛β细胞正常的功能和数量的作用尚不清楚。目的:1、探究FTZ含药血清改善高糖引起的氧化应激对INS-1胰岛β细胞损伤的作用及机制。2、探究FTZ含药血清改善氧化应激引起的INS-1胰岛β细胞凋亡的作用及机制。3、探究FTZ含药血清促进葡萄糖刺激的胰岛β细胞胰岛素释放的作用及机制。方法:1、将40只健康雄性SD大鼠平均分为2组,即给药组和空白组。大鼠禁食18h后灌胃FTZ混悬液,剂量为3 g提取物/kg体重。空白组灌予超纯水。连续灌胃3天,一天2次,末次灌胃1 h后腹主动脉取血。血液室温静止1h后离心处理(3000 r/min,15 min/次,2次),分离后合并同组大鼠血清,置水浴锅中,由室温开始升温至56℃,并维持30min。0.22μm滤膜过滤,制得ftz含药血清和大鼠空白血清。对ftz原料药、ftz含药血清、大鼠空白血清分别进行uplc/q-tof-ms分析。2、培养ins-1胰岛β细胞并进行分组,分别为对照组(control组),模型组(model组),阳性药物组(edaravone组),血清对照组(10%rat-serum组),低剂量含药血清组(0.4%ftz-serum组)、中剂量含药血清组(2%ftz-serum)和高剂量含药血清组(10%ftz-serum组)。control组细胞使用含有11mmol/l葡萄糖溶液和10%fbs的rpmi1640培养液进行培养;model组细胞使用含25mmol/l葡萄糖溶液和10%fbs的rpmi1640培养液进行培养;edaravone组细胞使用含有25mmol/l葡萄糖溶液、200μmol/ledaravone和10%fbs的rpmi1640培养液进行培养;10%rat-serum组细胞使用含25mmol/l葡萄糖溶液和10%大鼠空白血清的rpmi1640培养液进行培养;0.4%ftz-serum组细胞使用含有25mmol/l葡萄糖溶液、0.4%ftz含药血清和9.6%大鼠空白血清的rpmi1640培养液进行培养;2%ftz-serum组细胞使用含有25mmol/l葡萄糖溶液、2%ftz含药血清和8%大鼠空白血清的rpmi1640培养液进行培养;10%ftz-serum组细胞使用含有25mmol/l葡萄糖溶液和10%ftz含药血清的rpmi1640培养液进行培养,给药后,均培养48h。3、采用dcfh-da荧光探针试剂盒检测细胞内的ros水平;mda检测试剂盒检测细胞内脂质过氧化水平;提取细胞总蛋白,采用westernblot方法检测细胞内mn-sod、cat蛋白表达水平。4、采用annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒通过流式细胞仪测定ins-1胰岛β细胞的凋亡率;采用caspase9活性检测试剂盒和caspase3活性检测试剂盒分别检测ins-1胰岛β细胞内凋亡蛋白酶caspase9和caspase3的活性;提取细胞总蛋白,采用westernblot方法检测细胞内的抗凋亡蛋白bcl-2/bcl-xl及促凋亡蛋白bax的蛋白表达水平。5、采用ratinsulinelisa试剂盒检测ins-1胰岛β细胞中葡萄糖刺激的胰岛素释放浓度;提取细胞总蛋白,采用westernblot方法检测细胞内pdx-1和glut2蛋白表达水平。结果:1、ftz原料药、ftz含药血清、大鼠空白血清的uplc/q-tof-ms图谱结果显示,FTZ含药血清含有一定浓度的药物成分,大鼠空白血清中不含有药物成分。2、与Control组细胞相比,Model组细胞内的ROS、MDA浓度显著上升;Mn-SOD、CAT蛋白表达水平显著下降。与Model组细胞相比,FTZ含药血清可显著降低细胞内ROS和MDA浓度,提高Mn-SOD、CAT的蛋白表达量。3、与Control组细胞相比,Model组细胞的抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-xl的蛋白表达量没有明显的变化,但是促凋亡蛋白Bax的蛋白表达量显著提高,细胞内凋亡蛋白酶caspase 9和caspase 3的活性显著提高,细胞的凋亡率显著上升。与Model组细胞相比,FTZ含药血清可显著提高细胞的抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-xl的蛋白表达量,降低促凋亡蛋白Bax的蛋白表达量,10%的FTZ含药血清还可显著降低细胞凋亡蛋白酶caspase 9和caspase 3的活性,不同浓度的FTZ含药血清均可显著降低细胞的凋亡率。4、与Control组细胞相比,Model组细胞的PDX-1和Glut 2蛋白表达量显著下降,葡萄糖刺激的胰岛素释放浓度也显著降低。与Model组细胞相比,FTZ含药血清可显著提高细胞的PDX-1和Glut 2蛋白表达量,2%和10%FTZ含药血清可明显提高细胞中葡萄糖刺激的胰岛素释放浓度。结论:1、FTZ含药血清可通过降低细胞内ROS和MDA浓度,提高Mn-SOD和CAT蛋白表达量,改善高糖引起的氧化应激损伤;2、FTZ含药血清可通过提高细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-xl的蛋白表达量,抑制促凋亡蛋白Bax的蛋白表达量,降低细胞内caspase 9和caspase 3的活性,改善氧化应激引起的细胞凋亡;3、FTZ含药血清可通过提高细胞内PDX-1和Glut 2蛋白表达量,提高葡萄糖刺激的胰岛素释放浓度,改善氧化应激引起的胰岛素释放功能受损。
【关键词】：FTZ含药血清 胰岛β细胞 氧化应激 细胞凋亡 胰岛素
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1
【目录】：

• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 第一章 绪论14-21
• 1.氧化应激与2型糖尿病14-19
• 1.1 氧化应激的标志物及其测定15-16
• 1.2 氧化应激与胰岛 β 细胞16-18
• 1.3 氧化应激与胰岛素抵抗18
• 1.4 小结18-19
• 2.使用中药血清药理学方法研究中药复方的意义19
• 3.论文研究意义19-21
• 第二章 FTZ含药血清的制备21-28
• 1.实验材料和仪器21-22
• 1.1 药品与试剂21-22
• 1.2 实验仪器22
• 1.3 实验动物22
• 2.实验方法22-24
• 2.1 FTZ含药血清与大鼠空白血清的制备22
• 2.2 血清及FTZ供试品的制备22-23
• 2.3 UPLC-MS检测条件23-24
• 3.实验结果24-27
• 3.1 大鼠空白血清与FTZ大鼠含药血清的制备24
• 3.2 FTZ原药及血清UPLC-ESI-MS图谱24-27
• 4.本章小结27-28
• 第三章 FTZ含药血清改善INS-1 胰岛 β 细胞高糖引起氧化应激损伤的作用及机制探究28-47
• 1.实验材料和仪器28-33
• 1.1 材料28-32
• 1.2 仪器设备32-33
• 2.实验方法33-40
• 2.1 细胞培养33-34
• 2.2 细胞实验34-40
• 3.数据分析40
• 4.实验结果40-45
• 4.1 FTZ含药血清对INS-1 胰岛 β 细胞增殖活性的影响40-41
• 4.2 FTZ含药血清对INS-1 胰岛 β 细胞内ROS的影响41-43
• 4.3 FTZ含药血清对INS-1 胰岛 β 细胞内MDA的影响43
• 4.4 FTZ含药血清对INS-1 细胞内抗氧化蛋白酶表达水平的影响43-45
• 5.本章小结45-47
• 第四章 FTZ含药血清改善INS-1 胰岛 β 细胞氧化应激引起的凋亡作用及机制探究47-62
• 1.实验材料和仪器47-48
• 1.1 材料47-48
• 1.2 仪器设备48
• 2.实验方法48-53
• 2.1 Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测INS-1 细胞凋亡率48-49
• 2.2 检测INS-1 细胞的caspase9活性49-51
• 2.3 检测INS-1 细胞caspase3活性51-53
• 2.4 Western blot检测目的蛋白表达量53
• 3.数据分析53
• 4.实验结果53-61
• 4.1 FTZ含药血清对氧化应激的INS-1 细胞凋亡的影响53-56
• 4.2 FTZ含药血清对氧化应激的INS-1 细胞内caspase 9 活性的影响56
• 4.3 FTZ含药血清对氧化应激的INS-1 细胞内caspase 3 活性的影响56-57
• 4.4 FTZ含药血清对氧化应激的INS-1 细胞内Bcl-2 家族相关蛋白蛋表达的影响57-61
• 5.本章小结61-62
• 第五章 FTZ含药血清改善INS-1 胰岛 β 细胞葡萄糖刺激胰岛素释放作用及机制探究62-69
• 1.实验材料和仪器62-63
• 1.1 材料62-63
• 1.2 仪器设备63
• 2.实验方法63-65
• 2.1 Western blot检测目的蛋白表达量63
• 2.2 INS-1 胰岛 β 细胞分泌胰岛素的检测63-65
• 3.数据分析65
• 4.实验结果65-68
• 4.1 FTZ含药血清对氧化应激的INS-1 细胞内PDX-1 蛋白表达水平的影响65-66
• 4.2 FTZ含药血清对氧化应激的INS-1 细胞内Glut2蛋白表达水平的影响66-67
• 4.3 FTZ含药血清对INS-1 细胞葡萄糖刺激的胰岛素释放的影响67-68
• 5.本章小结68-69
• 第六章 结论与展望69-71
• 参考文献71-80
• 攻读硕士学位期间发表的论文80-81
• 英文简略表81-84
• 致谢84-85

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