氧化苦参碱对高脂诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗和脂代谢影响的研究

发布时间：2017-07-31 12:30

  本文关键词：氧化苦参碱对高脂诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗和脂代谢影响的研究

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【摘要】：随着现代生活水平的提高,肥胖的发病率日趋增加,而胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)作为肥胖、2型糖尿病、高脂血症、非酒精性脂肪肝等多种代谢性疾病的共同病理生理基础,已成为近年来的研究热点。氧化苦参碱是从中药苦参中提取的一种单体成分,既往研究表明氧化苦参碱具有抗炎、抗肿瘤、抗纤维化及免疫调节等多种药理学功能,近来研究表明氧化苦参碱与二甲双胍联合治疗可显著改善NAFLD患者的肝功能,明显减轻肝脏脂质沉积,增强其胰岛素敏感性,但具体机制尚不明确。本研究拟在体外细胞水平,通过观察氧化苦参碱对高脂诱导的HepG2细胞IR和脂代谢的影响,探讨其改善IR和脂代谢的分子机制,为临床用药提供理论依据。目的:观察中药制剂氧化苦参碱对高脂诱导的HepG2细胞IR和脂质沉积的影响,从胰岛素信号传导、脂代谢及氧化应激方面探讨其分子机制。方法:采用高脂(含0.25 mmol/L棕榈酸培养基)诱导法建立HepG2细胞的胰岛素抵抗模型。将HepG2细胞随机分为正常对照组和高脂干预组,分别干预24小时后,利用葡萄糖氧化酶法测定培养基中的葡萄糖浓度,并计算葡萄糖消耗率,判定造模是否成功。造模成功后将高脂干预组随机分为5组,分别为高脂组(Pa)、二甲双胍组(Met)(二甲双胍浓度0.20 mg/m L)、氧化苦参碱低剂量组(Omt-L)(氧化苦参碱浓度为0.04mg/m L)、氧化苦参碱中剂量组(Omt-M)(氧化苦参碱浓度为0.08 mg/m L)和氧化苦参碱高剂量组(Omt-H)(氧化苦参碱浓度为0.16 mg/m L),同时设立正常对照组(N)。分别干预48小时后收集细胞,采用相应试剂盒测定各组HepG2细胞内甘油三酯含量及氧化应激相关指标,即谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量;DCFH-DA(2,7-dichlorofuorescin diacetate)荧光染色检测细胞内活性氧(ROS)的含量;油红O染色观察细胞内脂质沉积程度;Real-Time PCR检测HepG2细胞胰岛素信号通路上INSR、IRS-1、Akt及GLUT4与脂代谢通路上SREBP-1c、FAS、ACC、SCD-1、CPT-1及CD36的m RNA表达水平;Western Blot检测HepG2细胞GLUT4、CD36、FAS、ACC及SCD-1蛋白的表达水平,以及IRS-1和Akt的总蛋白及磷酸化蛋白水平。结果:1 HepG2细胞IR体外模型的建立HepG2细胞经高脂干预24小时后,Pa组葡萄糖含量较N组升高,其差异有统计学意义(P0.05),提示胰岛素敏感性下降,表明棕榈酸诱导IR体外细胞模型建立成功。2 MTT法观察药物干预对HepG2细胞增殖的影响与N组相比,棕榈酸干预24h能够使HepG2细胞增殖抑制率上升,抑制率升高,差异有统计学意义(P0.05);与Pa组相比,Met、Omt-L、Omt-M、Omt-H均能降低HepG2细胞增殖抑制率(P0.05),但未能恢复至N组水平,而Omt-H2组则使HepG2细胞增殖抑制率明显升高,从而选取Omt-L、Omt-M、Omt-H三组的药物浓度为氧化苦参碱干预浓度。3 HepG2细胞胰岛素敏感性的变化3.1胰岛素信号通路相关指标基因表达水平的变化与N组相比,Pa组HepG2细胞INSR、IRS-1、Akt、GLUT4的m RNA表达下降,差异有统计学意义(P0.05);与Pa组相比,Met、Omt-M、Omt-H组干预后明显上调GLUT4的m RNA表达,与对照组无显著差异(P0.05),并且同时上调IRS-1、Akt、INSR的m RNA表达(P0.05),但未能恢复至N组水平;Omt-L可上调Akt及INSR的m RNA表达,但未恢复至N组水平(P0.05),同时明显上调GLUT4的m RNA表达(P0.05),此外,Omt-L组干预后可上调IRS-1的表达,但差异不具有统计学意义(P0.05)。3.2胰岛素信号通路关键分子的蛋白表达水平变化与N组相比,Pa组p-IRS-1/IRS-1的比值显著升高,p-Akt/Akt与GLUT4/β-actin均显著降低,差异具有统计学意义(P0.05);与Pa组相比,二甲双胍及氧化苦参碱不同剂量干预组中p-IRS-1/IRS-1的比值显著减低,而p-Akt/Akt、GLUT4/β-actin均显著增高,差异均具有统计学意义(P0.05),但p-Akt/Akt的比值未能恢复至正常水平。4.1药物干预对HepG2细胞脂质沉积的影响油红O染色及细胞内TG含量测定结果显示高脂干预后细胞内TG含量明显增加(P0.05);与Pa组相比,二甲双胍及氧化苦参碱不同剂量干预组HepG2细胞内TG含量明显降低(P0.05)。4.2棕榈酸干预后HepG2细胞内脂代谢相关指标表达水平的变化与N组相比,Pa组SREBP-1c、FAS、ACC、SCD-1及CPT-1的m RNA表达水平明显下降,CD36的m RNA表达水平明显升高,差异均具有统计学意义(P0.05);与N组相比,SREBP-1c、FAS、ACC及SCD-1在Pa组的蛋白表达明显降低,同时,CD36蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P0.05);4.3药物干预后脂肪酸转运及氧化关键因子的变化与Pa组相比,二甲双胍及氧化苦参碱不同剂量干预组CD36的m RNA水平显著降低(P0.05),其蛋白表达明显下降(P0.05);与Pa组相比,二甲双胍及氧化苦参碱不同剂量干预组CPT-1的m RNA表达显著升高(P0.05);5药物干预对HepG2细胞氧化应激的影响5.1活性氧(ROS)含量与N组相比,Pa组细胞内ROS的含量显著增加;二甲双胍及不同剂量的氧化苦参碱干预后可以显著降低ROS含量。5.2抗氧化酶T-SOD、GSH-Px及脂质过氧化物MDA的含量HepG2细胞经棕榈酸干预后,抗氧化酶GSH-Px、T-SOD的活性较N组均显著下降(P0.05),脂质过氧化物MDA的含量明显增加(P0.05),不同剂量氧化苦参碱及二甲双胍干预后,细胞内MDA较Pa组明显减少(P0.05),T-SOD及GSH-Px的活性较Pa组明显增高(P0.05),而药物干预组组间没有明显差异(P0.05)。结论:1氧化苦参碱可作用于胰岛素信号传导通路,减轻高脂诱导的HepG2细胞IR。2氧化苦参碱可通过抑制长链脂肪酸的吸收及增加游离脂肪酸的β氧化而改善高脂干预所致的HepG2细胞内脂质沉积。3氧化苦参碱可改善高脂诱导的HepG2细胞氧化应激状态,减少ROS4药物干预对HepG2细胞脂代谢的影响生成,降低MDA含量,恢复抗氧化酶GSH-Px及T-SOD的活性,进而改善HepG2细胞糖脂代谢。
【关键词】：胰岛素抵抗 氧化苦参碱 脂质沉积 氧化应激 HepG2细胞
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文缩写13-14
• 前言14-15
• 材料与方法15-32
• 结果32-35
• 附图35-45
• 附表45-47
• 讨论47-53
• 结论53-54
• 参考文献54-57
• 综述 代谢性炎症反应与胰岛素抵抗关系研究进展57-65
• 参考文献61-65
• 致谢65-67
• 个人简历67-68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 Vandana Saini;;Molecular mechanisms of insulin resistance in type 2 diabetes mellitus[J];World Journal of Diabetes;2010年03期

2 余小虎;朱金水;顾国妹;施建平;;氧化苦参碱联合二甲双胍对非酒精性脂肪肝患者胰岛素抵抗及血清TNFα的影响[J];临床肝胆病杂志;2007年03期

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本文编号：599186