酪氨酸磷酸酶Shp2在小鼠树突状细胞介导的过敏性哮喘中的作用研究

发布时间：2017-08-01 15:02

  本文关键词：酪氨酸磷酸酶Shp2在小鼠树突状细胞介导的过敏性哮喘中的作用研究

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【摘要】：哮喘是一种慢性小气道炎症疾病,属于I型超敏反应。哮喘的主要病理特征包括气道高反应性,以嗜酸性粒细胞浸润为主的炎症、杯状细胞化生及黏液过度分泌等。目前缺乏安全治愈哮喘的有效药物,解析哮喘的发病机制及其调控过程对于哮喘新型诊疗方案制定具有重要意义。树突状细胞(DC)是功能最强的抗原递呈细胞,被视为连接固有免疫和适应性免疫的桥梁。当外界抗原进入气道时,首先由DC识别并将抗原吞噬加工处理,在加工处理的同时也会向附近的淋巴结迁移,DC在迁移的过程中不断成熟,在淋巴结中促使Naive T细胞分化为Th2型细胞,Th2型细胞进一步激活B细胞使其产生大量IgE抗体吸附于肥大细胞表面,当外界相同的抗原再次入侵机体,抗原与IgE抗体结合,引起肥大细胞活化,分泌大量活性介质,导致气道痉挛和气道炎症。蛋白磷酸酶与激酶介导的可逆磷酸化调控是细胞信号传递中最广泛、最普遍的调控方式。Shp2由PTPl1 基因编码,是一种广泛表达的非受体型酪氨酸磷酸酶,参与了炎症反应、肿瘤的发生和免疫调节等许多重要的病理生理过程。而对于哮喘的关键起始过程的调控并无报道。前期研究发现Shp2可以参与肺上皮损伤及肺部炎症调控,这提示了Shp2在调控肺部损伤中的重要作用。目前关于Shp2对过敏性哮喘影响的研究主要集中在炎症发生的后期,包括维持IL-5诱导的嗜酸性粒细胞的存活以及正向调控气道上皮细胞TGF-β的产生从而影响哮喘后期的气道重构。最近的一项研究发现Shp2通过C型凝集素受体通路介导了DC抵抗白色念珠菌感染的过程。这提示我们Shp2在DC介导的免疫反应中具有重要作用。本项研究中,我们首先构建了DC特异性敲除Shp2的小鼠(Cdl 1c-CreShp2Flox/Flox)在无外界压力情况下敲除组小鼠与对照组在肺组织结构、白细胞分类计数等方面没有明显差异。其次我们利用HDM及OVA分别诱导小鼠产生过敏性哮喘,结果显示DC中缺失Shp2可以缓解由过敏原引起的哮喘。在哮喘的发病进程中,DC的吞噬、成熟、迁移以及抗原递呈都起到了非常重要的作用,因此我们对DC的各项功能分别做了检测。我们用OVA偶联Alexa-Flour 647的荧光染料与小鼠骨髓诱导分化的DC共孵育检测其对抗原的吞噬能力,结果显示Shp2缺失并不影响DC的吞噬。接着,我们对DC表面标记Cdllc以及与其成熟相关的共刺激分子CD80、CD86进行流式检测。检测发现Shp2缺失对于DC共刺激分子CD80、CD86的表达量没有影响。下一步我们利用Transwell小室对DC的迁移进行了检测,结果发现Shp2缺失可以明显抑制DC迁移。最后我们对DC骨架染色发现敲除Shp2可影响DC骨架重排。基于以上实验结果我们发现Shp2主要通过影响DC迁移进而影响哮喘的发病过程。该研究可以帮助更好地理解过敏性哮喘的病理过程,并为该疾病的诊断治疗提供新的治疗靶点。
【关键词】：Shp2 HDM OVA 过敏性哮喘 树突状细胞
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R562.25
【目录】：

• 致谢4-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 英文缩略词表11-16
• 1 引言16-20
• 2. 材料和试剂20-27
• 2.1 主要仪器20-21
• 2.2 主要试剂耗材21-22
• 2.3 小鼠22-23
• 2.4 细胞23
• 2.5 试剂配制23-27
• 2.5.1 LPS储存液23
• 2.5.2 HDM储存液23
• 2.5.3 福尔马林23
• 2.5.4 麻醉剂23
• 2.5.5 PBS配置23-24
• 2.5.6 核酸电泳缓冲液24
• 2.5.7 DNA Loading Buffer24
• 2.5.8 EDTA24-25
• 2.5.9 Tris Buffer25
• 2.5.10 Tris Buffer25
• 2.5.11 蛋白Running Buffer25
• 2.5.12 蛋白Trans Buffer25
• 2.5.13 Protein Loading Buffer25-26
• 2.5.14 白细胞计数液配置26-27
• 3. 实验方法27-37
• 3.1 小鼠基因型鉴定27-28
• 3.1.1 引物设计27
• 3.1.2 PCR反应体系27
• 3.1.3 PCR条件27-28
• 3.2 小鼠哮喘模型的建立及肺泡灌洗液处理28-29
• 3.2.1 HDM造模方法28-29
• 3.2.2 OVA造模方法29
• 3.3 肺组织切片和HE染色29-30
• 3.4 PAS染色30
• 3.5 免疫组化30-31
• 3.6 细胞免疫荧光31-32
• 3.7 细胞RNA提取及荧光定量PCR32
• 3.8 蛋白制样32-33
• 3.9 免疫印迹33-35
• 3.9.1 清洗玻璃板33
• 3.9.2 灌胶与上样33-34
• 3.9.3 电泳34
• 3.9.4 转膜34
• 3.9.5 免疫反应34-35
• 3.10 DC纯化35
• 3.11 DC抗原吞噬实验35-36
• 3.12 DC成熟实验36
• 3.13 体外DC迁移实验(Transwell实验)36-37
• 4. 实验结果37-50
• 4.1 构建树突状细胞特异性敲除Shp2的小鼠品系37-40
• 4.2 树突状细胞特异性敲除Shp2缓解HDM诱导的过敏性哮喘40-44
• 4.3 树突状细胞特异性敲除Shp2缓解OVA诱导的过敏性哮喘44-46
• 4.4 Shp2特异性缺失对树突状细胞的吞噬、成熟的影响46-48
• 4.5 Shp2缺失调控树突状细胞的迁移能力48-50
• 5. 讨论50-52
• 6. 结论52-53
• 附录53-55
• 参考文献55-57
• 靶向蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2的抑制剂研究进展57-73
• 参考文献68-73
• 作者简历及在读期间取得的科研成果73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 赵迎春;张前军;卢永仲;陈海燕;;小分子蛋白酪氨酸激酶抑制剂的合成研究进展[J];化学研究;2014年04期

2 吴狄;邓祥;王坤;黄小梅;;蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)及其抑制剂的研究进展[J];广州化工;2012年09期

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本文编号：604790