去泛素化酶CYLD对高糖诱导的小鼠肾系膜细胞NF-KB炎症信号的调控研究

发布时间：2017-08-02 04:18

  本文关键词：去泛素化酶CYLD对高糖诱导的小鼠肾系膜细胞NF-KB炎症信号的调控研究

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【摘要】：目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病特有而严重的微血管并发症,也是西方国家终末肾病(end stage renal defailure,ESRD)产生并最终依靠肾透析维持生命的主要原因。大量研究显示,在糖尿病肾病早期肾组织中即见到单核巨噬细胞浸润、核因子κB(NF-κB)等炎症因子产生增加,提示糖尿病肾病的发生发展与炎症有密切关联,而NF-κB在炎症反应中具有重要作用。在所有炎症反应中均可以发现NF-κB活性增高,当抑制其活性以后炎症的病理过程则被阻止。我们前期研究已证实了泛素化修饰在对高糖诱导的NF-κB信号的活化中有重要调节作用。然而NF-κB信号的调节机制复杂,泛素化修饰是一个动态平衡过程,NF-κB信号通路也受到去泛素化修饰的调节。在众多调节NF-κB信号去泛素化酶中,去泛素化酶圆柱瘤蛋白(cylindromatosis,CYLD)是NF-κB信号的主要负性调控因子和炎症抑制因子之一。目前有关CYLD与糖尿病肾病的研究却鲜有报道。为此,本研究首先通过观察高糖刺激后小鼠肾系膜细胞CYLD、总IKBα、p-IKBα、p-NF-κB p65、IKKγ、MCP-1、IL-6、IL-8表达变化,然后分别沉默和过表达CYLD基因,检测高糖诱导的NF-κB通路中总的IKBα、p-IKBα、IKKγ、p-NF-κB p65及下游炎症因子MCP-1、IL-6、IL-8的表达,探讨去泛素化酶CYLD在糖尿病肾病NF-KB信号通路激活中的调控作用。方法:(1)细胞培养及分组:体外培养小鼠肾系膜细胞,以高糖作为刺激因子,再分别沉默及过表达cyld基因,实验分组设为:1.正常对照组(nc组):培养基含葡萄糖5.6mmol/l;2.高糖干预组(hg1、hg2、和hg3组):培养基含葡萄糖浓度分别为10、20、30mmol/l;3.甘露醇组(op组):含5.6mmol/l葡萄糖以及24.4mmol/l的甘露醇保持总渗透压在30mmol/l;4.cyldsirna干扰组:培养基内含100nmol/lcyldsirna干扰序列;5.cyld过表达组:培养基内含过表达cyld目的基因的滴度为1*108tu/ml,moi值为50的慢病毒;6.空载体组:培养基内含不带有cyld目的基因的滴度为1*108tu/ml,moi值为50的阴性对照病毒con235。(2)各组分别作用6h、12h、24h、48h、72h后用蛋白免疫印迹、rt-pcr法检测cyld、总iκbα、p-nf-κbp65、p-iκbα、ikkγ表达,用elisa法检测nf-κb下游炎症因子mcp-1、il-6、il-8的表达水平。(3)用spss17.0统计软件分析,并以均数±标准差(??±s)来表示,各组间比较用单因素方差分析,两两比较采用q检验,p0.05表示差异有统计学意义。结果:1、与nc组比较,高糖刺激使各组系膜细胞的cyld、总量iκbα蛋白和mrna表达减弱(p0.05),而p-iκbα、p-nf-κbp65和mcp-1、il-6、il-8表达增强(p0.05)且具有时间、浓度依赖性;2、高糖刺激对ikkγ蛋白和mrna表达水平无明显影响(p0.05);3、使用sirna干扰cyld,再用高糖刺激后,iκbα总蛋白表达进一步减弱,而p-iκbα、p-nf-κbp65和mcp-1表达进一步增强。4、过表达cyld慢病毒转染系膜细胞,再用高糖刺激后iκbα总蛋白表达水平增高,信号分子p-IκBα、p-NF-κB P65蛋白和MCP-1、IL-6、IL-8表达减弱,提示CYLD在高糖状态下可负性调控NF-κB信号通路。结论:1、高糖可激活NF-κB信号通路而介导下游炎症因子MCP-1、IL-6、IL-8表达参与肾脏炎症发生;2、去泛素化酶CYLD能负性调控高糖诱导的NF-κB炎症信号。3、高糖可通过下调CYLD的表达参与肾系膜细胞NF-κB炎症信号通路的激活,去泛素化酶CYLD的下调可能是糖尿病肾病炎症发病的又一重要机制。
【关键词】：糖尿病肾病 去泛素化酶CYLD 核因子κB 炎症
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-13
• 材料与方法13-35
• 结果35-57
• 讨论57-64
• 结论64-65
• 参考文献65-70
• 英汉缩略对照表70-71
• 致谢71-72
• CYLD和NF-κB相关研究进展(综述)72-86
• 参考文献82-86

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本文编号：607604