结节性硬化症新靶向治疗的探索和肿瘤免疫治疗融合蛋白的制备

发布时间：2017-08-03 15:13

  本文关键词：结节性硬化症新靶向治疗的探索和肿瘤免疫治疗融合蛋白的制备

  更多相关文章： 结节性硬化症 谷氨酰胺 GSK3β BPTES 氯化铝 检查点 免疫治疗 PD1 LAG3 免疫球蛋白(Ig)融合蛋白

【摘要】：结节性硬化症(Tuberous sclerosis complex,TSC)是一常染色体显性遗传多系统良性肿瘤综合症,TSC1或TSC2突变引起m TOR过度活化,导致患者发生癫痫、发育迟缓、智力受损和自闭症,癫痫大发作,颅内高压,肾脏肿瘤破裂出血、肾功能衰竭,呼吸衰竭,可危及病人生命。因为受众相对较少,与其它罕见病一样,人们对结节性硬化症缺乏重视,药物鲜有开发,虽然m TOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin)及其衍生物是TSC的靶向治疗药物,但由于雷帕霉素只是抑制细胞增长而不是杀死细胞,停药后肿瘤会恢复生长。因此,需要寻找更好的治疗方法,是目前亟待解决的问题。由于m TOR活化可引起有氧糖酵解、谷氨酸依赖等代谢异常,为了探索结节性硬化症(TSC)的新疗法,我们使用糖酵解抑制剂(3-溴丙酮酸,3-Br PA)、谷氨酰胺酶抑制剂(BPTES)、GSK3β抑制剂(Licl、Li2CO3)处理正常细胞系(WT)和m TOR活化的细胞系(TSC2-/-、Pten-/-),发现3-Br PA、BPTES、Licl及Li2CO3都能有效抑制m TOR活化的细胞系(TSC2-/-、Pten-/-)的增殖。由于全身性Tsc1或Tsc2缺失小鼠均是胚胎致死,我们建立了生后21天死亡的TSC1神经元(Synapsin-cre,TSC~(1Lox P/LoxP))和50天死亡的神经星形胶质细胞(GFAP-cre,TSC~(1Lox P/LoxP))特异性敲除的两种小鼠模型,3-Br PA、BPTES未能改善Synapsin-cre,TSC~(1Lox P/LoxP)小鼠的生存期,以上3类抑制剂将用于治疗GFAP-cre,TSC~(1Lox P/LoxP)小鼠。机体免疫系统时时刻刻监视体内突变的细胞,识别并将它们清除,称之为免疫监视。但是与此同时,肿瘤细胞能够利用多种机制逃避免疫系统的监视,最终在体内增殖(肿瘤免疫逃逸)。肿瘤发生与否以及肿瘤发生后的转归取决于这两者的相互作用。T细胞能够直接杀伤表达肿瘤特异性抗原的肿瘤细胞,是肿瘤免疫的重要组成之一。杀伤性T细胞的活化方式为:肿瘤浸润T细胞表面的TCR与肿瘤细胞表面的MHC-抗原复合物结合,活化T细胞,通过促进T细胞分泌细胞因子或颗粒酶等,对特定的肿瘤细胞直接进行杀伤作用。T细胞的激活除了受第一信号(TCR通路)的调控之外,还受各种共刺激及共抑制分子的调控,其中共抑制分子被称为检查点(Checkpoint)分子。随着免疫检查点分子(CTLA-4)阻断剂(CTLA-4融合蛋白及单抗)取得突破性进展之后,在肿瘤免疫治疗领域,免疫检查点阻断治疗(主要是PD1/PD-L1阻断治疗)成为与CAR-T疗法并驾齐驱的两个重大方向。由于肿瘤逃逸机制的多样性,联合免疫治疗(传统疗法与免疫疗法的联合、各种免疫疗法之间的联合)成为肿瘤治疗的趋势。本次研究中,我们设计和构建了由两个免疫检查点分子(LAG3及PD1)胞外段组成的Fc融合蛋白:LAG3-PD1-Fc和PD1-LAG3-Fc融合蛋白的哺乳动物表达质粒。然后在HEK293表达系统中成功表达这两个Fc融合蛋白,并确定了两者的分子量大小,为功能研究和临床应用奠定了基础。
【关键词】：结节性硬化症 谷氨酰胺 GSK3β BPTES 氯化铝 检查点 免疫治疗 PD1 LAG3 免疫球蛋白(Ig)融合蛋白
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R596
【目录】：

• 第一部分 结节性硬化症新靶向治疗的探索10-33
• 中文摘要10-11
• 英文摘要11-12
• （一）前言12-15
• （二）材料和方法15-21
• 1. 材料15-17
• 1.1 细胞系15
• 1.2 抗体和试剂15-16
• 1.3 仪器和材料16-17
• 2. 方法17-21
• （三）结果21-29
• 1.谷氨酰胺酶抑制剂降低m TOR活化细胞的增值21-23
• 2．3-Br PA和BPTES对Tsc1神经元敲除小鼠无显著疗效23-25
• 3. Li Cl和Li_2CO_3减弱mTOR活化细胞的增值能力25-28
• 4. 构建GFAP-Cre，，TSC1~(loxp/loxp)小鼠28-29
• （四）结论29
• （五）讨论29-31
• （六）参考文献31-33
• 第二部分 肿瘤免疫治疗融合蛋白的制备33-60
• 中文摘要33-34
• 英文摘要34-35
• （一）前言35-39
• （二）材料和方法39-51
• 1. 材料39-42
• 1.1 菌种和载体39
• 1.2 抗体和试剂39-42
• 2. 方法42-51
• 2.1 基因克隆的基本实验42-50
• 2.2 抗体纯化相关实验50-51
• （三）结果51-56
• 1. LAG3-PD1-Fc及PD1-LAG3-Fc的结构51-52
• 2. 重组质粒结构的鉴定52-54
• 3. 融合蛋白的表达及鉴定54-56
• （四）结论56
• （五）讨论56-58
• （六）参考文献58-60
• 文献综述 免疫检查点阻断治疗的进展60-66
• 参考文献64-66
• 攻读学位期间发表文章情况66-67
• 致谢67-68

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本文编号：614977