β-羟丁酸抗硝基化干预糖尿病心脏微血管病变的机制

发布时间：2017-08-17 07:03

  本文关键词：β-羟丁酸抗硝基化干预糖尿病心脏微血管病变的机制

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【摘要】：目的:糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是由高血糖引起的慢性代谢性疾病,预计到2035年全球糖尿病患病人数将上升到5.9亿。心脏微血管病变是糖尿病在心脏的特征性改变,其典型的病理变化是血管基底膜增厚致微循环障碍。糖尿病时,微血管内皮功能紊乱,可导致血管基底膜的主要成分发生改变,病理基础是Ⅳ型胶原积聚,氧化应激引起的硝基化是核心病变。血管基底膜的主要成分Ⅳ型胶原的生成,主要受转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)通路的调控。TGF-β1通路主要经由Smad3激活Ⅳ型胶原基因转录。研究发现Smad3敲除,可使Ⅳ型胶原的α1链不表达。目前,糖尿病微血管基底膜增厚的内在机制尚未明确,且无特效的临床治疗手段,深入研究Ⅳ胶原的积聚的分子机制,可为糖尿病心脏微血管并发症的有效防治提供治疗新思路。酮体作为生物活性小分子,由β-羟丁酸(β-hydroxybutyrate,β-HB)(70%)、乙酰乙酸(30%)和丙酮(微量)组成,在心血管系统中发挥多种保护功能。有报道研究,酮体的主要成分,β-HB可有效抑制氧化应激引起的细胞损伤,而心血管系统是其主要的作用部位。研究发现,不同于传统的抗氧化剂,β-HB可参与调控基因表达。此外,β-HB还可作为Ⅰ类组蛋白脱乙酰基酶(Histone deacetylase,HDAC)的内源性和特异性的抑制剂,选择性提高抗氧化保护性基因启动子区的组蛋白乙酰化水平,起到抗氧化应激的作用。本实验采用人心脏微血管内皮细胞(Human cardiac microvascular endothelial cells,HCMEC),首先应用不同浓度糖溶液培养HCMEC细胞,寻找模拟糖尿病高糖状态的最佳浓度;不同浓度的β-HB高糖溶液培养HCMEC细胞,作用时间相同,确定β-HB的最佳作用浓度。采用实时定量聚合酶链式反应(Realtime-PCR,RT-PCR)检测Ⅳ型胶原α1链(TypeⅣCollangenα1 chain,Ⅳα1)、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)及基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase,MMP-9)m RNA水平变化,酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞培养液中Ⅳ型胶原的含量。蛋白质印迹法(Western Blot)检测细胞中P300、Smad3和HDAC3的硝基化水平变化;免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)技术,检测Smad3分别与P300、HDAC3的结合;细胞免疫荧光检测硝基酪氨酸(Nitrotyrosine,NT)含量。据此,探讨β-HB抗硝基化,调控Ⅳ型胶原基因表达的分子机制,为治疗提供实验依据。方法:1细胞培养:人心脏微血管内皮细胞HCMEC,购自美国模式菌种收集中心(ATCC)。HCMEC细胞用含5%胎牛血清的ECM低糖培养基培养,0.25%胰蛋白酶消化传代,接种于250 ml培养瓶中,在37℃、5%CO2培养箱中培养。用β-HB、3-吗啉-斯德酮亚胺(3-morpholinosydnonimine,SIN-1)及四磺基苯基铁卟啉(5,10,15,20-Tetrakis-(4-sulfonatophenyl)porphyrinato-iron(Ⅲ),Fe TPPs)处理HCMEC细胞,SIN-1组应用低糖ECM培养基培养+SIN-1,β-HB及Fe TPPs组分别应用高糖ECM培养+β-HB及Fe TPPs培养。2细胞实验设计与分组:2.1探讨不同糖浓度ECM对HCMEC细胞中Ⅳα1、MMP-9、i NOS基因表达影响用不同糖浓度ECM培养HCMEC细胞24 h,根据不同糖浓度的ECM分为5组:Con组(正常对照,细胞用低糖-ECM培养)、20 m M组(细胞用含20 m M的葡萄糖-ECM培养)、25 m M组(细胞用含25 m M的葡萄糖-ECM培养)、30 m M组(细胞用含30 m M的葡萄糖-ECM培养)及35 m M组(细胞用含35 m M的葡萄糖-ECM培养)。2.2探讨不同浓度的β-HB对HCMEC细胞中Ⅳα1、MMP-9和i ONS m RNA表达的影响根据β-HB浓度不同分为5组:Con组(正常对照,细胞用低糖-ECM培养)、高糖组(细胞用含30 m M的葡萄糖-ECM培养)、β-HB2组(0.02m Mβ-HB+30 m M高糖组)、β-HB4组(0.04 m Mβ-HB+30 m M高糖组)和β-HB6组(0.06 m Mβ-HB+30 m M高糖组)。2.3 HCMEC细胞中Ⅳα1 m RNA表达水平的检测Trizol一步法分别提取HCMEC细胞中总RNA;用β-actin做内参,RT-PCR方法检测Ⅳα1 m RNA表达。2.4 ELSIA检测细胞培养液中Ⅳ型胶原蛋白含量;Western blot检测HCMEC细胞中P300、Smad3、HDAC3及NT蛋白含量;Co-IP检测HCMEC细胞中Smad3与P300、HDAC3的结合活性实验分成5组:Con组(正常对照,细胞用低糖-ECM培养)、高糖组(细胞用含30 m M的葡萄糖-ECM培养)、SIN-1组(细胞用低糖-ECM+5 m M SIN-1培养)、β-HB组(细胞用含30 m M的葡萄糖-ECM+0.04 m Mβ-HB培养)、Fe TPPs组(细胞用含30 m M的葡萄糖ECM+5 m M Fe TPPs培养)。2.5利用免疫荧光法,检测HCMEC细胞中NT含量变化2.6统计学处理所有实验均重复三次,数据采用均数±标准差(X?S)表示,采用SPSS16.0软件进行统计学处理分析,对所测定数据分析均采用One-Way-ANOVA法进行单因素方差分析,P0.05为差异有统计学显著意义。结果:1 RT-PCR检测不同糖浓度ECM对HCMEC中Ⅳα1、MMP-9和i NOS m RNA表达Ⅳα1 m RNA的相对表达量与Con组比20 m M组(2.56±0.06,P0.05)、25 m M组(2.43±0.18,P0.05)、30 m M组(4.97±0.46,P0.01)及35 m M组(2.41±0.17,P0.05)均明显升高。MMP-9 m RNA的相对表达量与Con组比20 m M组(0.16±0.03,P0.05)、25 m M组(0.09±0.04,P0.05)、30 m M组(0.02±0.01,P0.01)及35 m M组(0.05±0.02,P0.05)均明显降低。i NOS m RNA的相对表达量与Con组比20 m M组(1.30±0.19,P0.05)、25 m M组(2.12±0.03,P0.05)、30 m M组(3.05±0.05,P0.01)及35 m M组(2.07±0.02,P0.05)均升高。2 RT-PCR检测不同浓度β-HB对HCMEC细胞中Ⅳα1、MMP-9和i NOS m RNA表达的影响Ⅳα1 m RNA的相对表达量与HG组比β2组(0.27±0.02,P0.05)、β4组(0.15±0.01,P0.01)及β6组(0.32±0.02,P0.05)均降低。MMP-9 m RNA的相对表达量与HG组比β2组(1.10±0.01,P0.05)、β4组(1.73±0.03,P0.01)及β6组(1.01±0.01,P0.05)均升高。i NOS m RNA的相对表达量与HG组比β2组(0.56±0.03,P0.05)、β4组(0.15±0.01,P0.01)及β6组(0.38±0.02,P0.05)均降低。3 RT-PCR检测HCMEC细胞中Ⅳα1 m RNA表达的影响。与Con组比HG组(2.17±0.11,P0.05)及SIN-1组(1.94±0.08,P0.05)升高;与HG组比较β-HB组(1.21±0.10,P0.05)及Fe TPPs组(0.93±0.08,P0.01)均降低。4 ELISA检测细胞培养液中Ⅳ型胶原蛋白含量。与Con组比较HG组(6.58±0.04 pg/m L,P0.05)、SIN-1组(4.57±0.07 pg/m L,P0.05)Ⅳ型胶原蛋白含量明显升高,均有统计学差异;而β-HB组(3.21±0.12 pg/m L,P0.05)及Fe TPPs组(3.33±0.01 pg/m L,P0.05)Ⅳ型胶原蛋白含量与Con组比较无统计学差异。5 Western blot法检测各组HCMEC细胞中P300、Smad3、HDAC3及NT蛋白含量。P300蛋白相对表达量与Con组比HG组(0.42±0.02,P0.01)及SIN-1组(0.29±0.01,P0.05)升高;与HG组比较β-HB组(0.17±0.01,P0.01)及Fe TPPs组(0.15±0.01,P0.05)均降低。Smad3蛋白相对表达量与Con组比HG组(0.96±0.01,P0.01)及SIN-1组(0.85±0.03,P0.05)升高;与HG组比较β-HB组(0.46±0.02,P0.01)及Fe TPPs组(0.82±0.01,P0.05)均降低。HDAC3蛋白相对表达量与Con组比HG组(2.17±0.11,P0.01)及SIN-1组(1.94±0.08,P0.01)升高;与HG组比较β-HB组(1.21±0.10,P0.01)及Fe TPPs组(0.93±0.08,P0.01)均降。NT蛋白相对表达量与Con组比HG组(0.42±0.02,P0.01)及SIN-1组(0.39±0.02,P0.05)升高;与HG组比较β-HB组(0.17±0.02,P0.01)及Fe TPPs组(0.15±0.01,P0.05)均降低。6 Co-IP技术检测各组HCMEC细胞中Smad3与P300、HDAC3的结合活性6.1 Smad3与P300结合活性检测Con组、HG组、SIN-1组、β-HB组及Fe TPPs组细胞蛋白裂解液分别加入Smad3抗体沉淀处理后,Western blot结果分析显示与Con组比较,HG组Smad3与P300蛋白结合量(4.79±0.27,P0.01)明显高于Con组(1.40±0.17);β-HB组及Fe TPPs组Smad3与P300蛋白结合量分别为(2.06±0.31,P0.01)与(2.98±0.03,P0.05),与HG组比较明显降低。Con组、HG组、SIN-1组、β-HB组及Fe TPPs组细胞蛋白裂解液分别加入P300抗体沉淀处理后,Western blot结果分析显示:HG组及SIN-1组P300与Smad3蛋白结合量(5.24±0.18,P0.01)与Con组(1.23±0.07)比较,明显升高;而β-HB组及Fe TPPs组P300与Smad3蛋白结合量为(2.11±0.26,P0.01)与(3.46±0.10,P0.05)低于HG组。6.2 Smad3与HDAC3结合活性检测Con组、HG组、SIN-1组、β-HB组及Fe TPPs组细胞蛋白裂解液分别加入Smad3抗体沉淀处理后,Western blot结果分析显示:与Con组比较,HG组Smad3与HDAC3蛋白结合量(3.47±0.18,P0.05)明显高于Con组(1.21±0.11);β-HB组及Fe TPPs组Smad3与HDAC3蛋白结合量为(1.72±0.17,P0.01)和(2.39±0.19,P0.05),与HG组比较明显降低。Con组、HG组、SIN-1组、β-HB组及Fe TPPs组细胞蛋白裂解液分别加入HDAC3抗体沉淀处理后,Western blot结果分析显示:HG组及SIN-1组HDAC3与Smad3蛋白结合量(4.15±0.25,P0.01)与Con组(1.28±0.14)比较,明显升高;而β-HB组及Fe TPPs组HDAC3与Smad3蛋白结合量为(1.87±0.10,P0.01)和(2.03±0.23,P0.05)低于HG组。7免疫荧光法检测HCMEC细胞中NT含量。与Con组比较HG组及SIN-1组NT荧光强度均明显增强,以HG组最为显著;而β-HB组及Fe TPPs组NT荧光强度与HG组比较明显减弱。结论:1β-HB可明显抑制高糖(30 m M)引起的HCMEC细胞中Ⅳ型胶原α1链表达,其抑制强度以0.04 m Mβ-HB浓度最为显著。2β-HB能够抑制高糖(30 m M)引起的HCMEC细胞中P300、Smad3、HDAC3及NT蛋白表达。3β-HB能够抑制高糖(30 m M)引起的HCMEC细胞中Smad3与P300及HDAC3之间相互作用。
【关键词】：β-羟丁酸 人心脏微血管内皮细胞 硝基化 Ⅳ型胶原 糖尿病心脏微血管病变
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2
【目录】：

• 中文摘要4-10
• 英文摘要10-17
• 英文缩写17-18
• 前言18-20
• 材料与方法20-31
• 结果31-33
• 附图33-41
• 讨论41-45
• 结论45-46
• 参考文献46-50
• 综述 糖尿病心脏微血管病变机制50-61
• 参考文献56-61
• 致谢61-62
• 个人简历62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 Mark T Waddingham;Amanda J Edgley;Hirotsugu Tsuchimochi;Darren J Kelly;Mikiyasu Shirai;James T Pearson;;Contractile apparatus dysfunction early in the pathophysiology of diabetic cardiomyopathy[J];World Journal of Diabetes;2015年07期

2 Marcello C Bertoluci;Gislaine V Cé;Antnio MV da Silva;Marco V Wainstein;Winston Boff;Marcia Puales;;Endothelial dysfunction as a predictor of cardiovascular disease in type 1 diabetes[J];World Journal of Diabetes;2015年05期

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本文编号：687637