葛根素对成骨细胞miRNA-204的调控及其与Runx2基因表达的关系

发布时间：2017-08-18 12:20

  本文关键词：葛根素对成骨细胞miRNA-204的调控及其与Runx2基因表达的关系

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【摘要】：目的：研究葛根素对成骨细胞MC3T3-E1增殖能力、分化能力、miRNA表达的影响以及其与Runx2基因表达的关系。方法：1.MTT法检测葛根素作用于MC3T3-E1细胞后成骨细胞的增殖能力,用终浓度为0.01mg/ml的葛根素处理,并设一个空白对照组,加入等体积的α-MEM培养液,每组设6个复孔分别继续培养24h、48h、72h后检测OD值。2.碱性磷酸酶活性检测葛根素对成骨细胞分化能力的影响,传代培养成骨细胞后,进行细胞爬片,等待细胞爬片成功后,弃掉培养液,用PBS清洗3次,依据ALP染色试剂盒说明书的方法,给细胞染色。3.葛根素作用于成骨细胞后,分别提取RNA和蛋白质,采用RT-PCR法检测Runx2的mRNA表达水平和和用western blot法检测Runx2蛋白表达水平。4.采用PicTar、Target Scan、等靶点预测软件预测靶向Runx2的miRNA,并与表达谱测定的葛根素作用MC3T3-E1前后miRNA变化作比较。5.采用RT-PCR验证葛根素作用MC3T3-E1前后靶向Runx2基因的miRNA表达量。6.构建Runx2 3'UTR/突变型Runx2 3'UTR重组质粒、合成miRNA-204mimics和miRNA-204NC共转染MC3T3-E1细胞,用双荧光素酶报告基因系统验证Runx2与miRNA-204的靶向关系。7.分别用miRNA-204inhibitor和miRNA-204mimics转染MC3T3-E1细胞,RT-PCR和western blot检测转染前后Runx2的mRNA表达量和蛋白表达量的变化。结果：葛根素作用后,与空白对照组比较：1.成骨细胞增殖能力提高；2.ALP活性提高；3.Runx2的mRNA和蛋白表达水平上升;4. miRNA表达谱和靶点预测软件预测靶向Runx2的miRNA共同有miR-204、miRNA-344f-5p; 5.PCR结果显示miRNA-204和miRNA-344f-5p表达水平下降,miRNA-2861表达水平上升,miRNA-23a-5p、 miRNA-770-5p、miRNA-871-5p表达水平无明显改变；6.双荧光素酶报告基因法结果显示,细胞转染48h后,只有Runx2 3'UTR+miRNA-204 mimics组荧光素蛋白的表达水平显著降低,说明只有miRNA-204可抑制Runx2 3'UTR报告基因的表达；7.过表达miRNA-204后Runx2的蛋白表达水平下降,干扰miRNA-204表达后Runx2的蛋白水平上升。结论：葛根素可提高成骨细胞增殖、分化能力,并调节可能靶向Runx2的miRNA,为进一步研究葛根素促进成骨细胞发育的机理研究提供可靠的依据。
【关键词】：葛根素 增殖 成骨细胞 Runx2 miRNA-204
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R580
【目录】：

• 摘要8-9
• Abstract9-10
• 英文缩写10-11
• 第一章 绪论11-14
• 研究背景11-13
• 研究内容13
• 研究意义13-14
• 第二章 实验研究14-43
• 第一部分 中药葛根对成骨细胞Runx2表达的影响14-23
• 实验一 MTT法检测葛根素对成骨细胞增殖能力的影响14-15
• 1 材料14
• 2 方法14-15
• 3 数据分析15
• 4 结果15
• 5 讨论15
• 实验二 碱性磷酸酶活性检测葛根素对于成骨细胞活力影响15-17
• 1 材料16
• 2 方法16
• 3 数据分析16
• 4 结果16
• 5 讨论16-17
• 实验三 qRT-PCR法检测葛根素作用于成骨细胞后Runx2基因表达的影响17-20
• 1 材料17
• 2 方法17-18
• 3 数据分析18
• 4 结果18-19
• 5 讨论19-20
• 实验四: Western blot法检测葛根素对成骨细胞后Runx2蛋白表达水平的影响20-23
• 1 材料20
• 2 方法20-22
• 3 数据分析22
• 4 结果22-23
• 5 讨论23
• 第二部分 靶向Runx2的microRNA的筛选和验证23-33
• 实验一 microRNA表达谱检测葛根素作用成骨细胞后发生改变的microRNA23-25
• 1 材料23-24
• 2 方法24
• 3 结果24-25
• 4 讨论25
• 实验二 靶向Runx2的microRNA的预测25-26
• 实验三 qRT-PCR验证葛根素作用后成骨细胞中可能靶向Runx2的miRNA的表达的变化26-30
• 1 材料27-28
• 2 方法28-29
• 3 数据处理29
• 4 结果29-30
• 5 讨论30
• 实验四 构建重组质粒,双荧光素酶报告基因系统验证miRNA-204与Runx2的靶向关系30-33
• 1 材料30
• 2. 方法30-32
• 3 结果32-33
• 4 讨论33
• 第三部分 转染microRNA-204后对成骨细胞Runx2的表达的影响33-41
• 实验一 PCR验证转染microRNA-204对成骨细胞Runx2 mRNA的影响33-35
• 1 材料33-34
• 2 miRNA-204基因的过表达和干扰34
• 3 数据分析34
• 4. 结果34-35
• 5. 讨论35
• 实验二 Western blot法检测转染microRNA-204对成骨细胞Runx2 mRNA的影响35-38
• 1 材料35-36
• 2 方法36-37
• 3 数据分析37
• 4 结果37-38
• 5 讨论38
• 实验三 MTT法检测miRNA-204对成骨细胞增殖能力的影响38-40
• 1 材料38
• 2 方法38-39
• 3 数据分析39
• 4 结果39
• 5 讨论39-40
• 实验四 碱性磷酸酶活性检测转染miRNA-204对成骨细胞活力的影响40-41
• 1 材料40
• 2 方法40
• 3 数据分析40
• 4 结果40-41
• 5 讨论41
• 第四部分 总结41-43
• 综述43-48
• 参考文献48-54
• 在校期间攻读硕士学位学术成果54-55
• 致谢55

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3 刘海文;葛根素治疗糖尿病血管并发症[N];中国医药报;2005年

4 陶春祥;葛根素的临床应用[N];中国中医药报;2002年

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本文编号：694535