阿魏酸促进糖尿病大鼠慢性创面血管化及其作用机制研究

发布时间：2017-08-20 02:27

  本文关键词：阿魏酸促进糖尿病大鼠慢性创面血管化及其作用机制研究

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【摘要】：目的在体内试验中,研究阿魏酸(ferulic acid,FA)对2型糖尿病大鼠慢性创面愈合的影响。在体外实验中,分别在常氧和缺氧状态下,探讨不同浓度阿魏酸对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)血管生成相关功能的影响;研究阿魏酸对HUVEC细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板衍化生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)及缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达的影响;研究阿魏酸调节HUVEC细胞VEGF及PDGF基因的表达与细胞外调蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)信号通路的关系。方法我们以凡士林为基质,制作了阿魏酸软膏。为了研究阿魏酸的软膏制剂在水中的释放度,分别将2%、5%及10%的阿魏酸软膏各150mg分别置入50ml纯水中,在不同时间点取样,用比色法测量吸光度值,计算阿魏酸在水中释放度。以高糖高脂鼠料喂养SD大鼠4周后,再以45mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素,监测空腹血糖值,建立2型糖尿病大鼠模型。建立糖尿病大鼠慢性创面模型,分别设置糖尿病对照组(diabetic control group,DC)、凡士林对照组(vaseline control group,VC)、生理盐水对照组(normal saline control group,NSC)、10%阿魏酸外用组(10%ferulic acid ointment treatment group,10%FA)和40mg/kg阿魏酸灌胃组(40mg/kg ferulic acid irrigation treatment group,40mg FA),观察不同处理对各组创面愈合率及愈合时间的影响,CD34免疫组织化学染色观察阿魏酸对慢性创面血管生成的影响。原代培养HUVEC细胞,分别在常氧和缺氧条件下实验。以不同浓度的阿魏酸(1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4及1×10-3 mol/L)处理后,分别采用MTS法、划痕法、Matrigel法分析不同浓度阿魏酸处理对HUVEC细胞的增殖、迁移和管腔样结构形成的影响;以1×10-5mol/L阿魏酸处理HUVEC细胞后,在0h、3h、6h、24h时提取蛋白,采用western blot分析对血管生成密切相关的因子VEGF、PDGF及HIF-1α表达的影响;以ERK1/2信号通路特异性抑制剂PD98059预处理HUVEC细胞,阻断ERK1/2信号通路后,再采用1×10-5mol/L阿魏酸处理6h,western blot分析VEGF及PDGF蛋白表达的变化。结果分析阿魏酸软膏在水中的释放度,12h时2%、5%及10%的阿魏酸软膏的释放度分别达到8.6%、11.2%和16.2%;在24h时分别达到10.4%、13.2%和21.8%。阿魏酸软膏在水中的释放良好,可以用于慢性创面的治疗。SD大鼠以高糖高脂鼠料喂养4周后,采用小剂量链脲佐菌素腹腔注射,监测血糖值,维持在16.7mmol/L以上至少4周,成功建立了2型糖尿病大鼠模型。慢性创面造模后,第16天,10%FA组创面愈合率为94.0±5.7%,高于VC组的87.2±6.4%;40mg FA组的创面愈合率为91.3±6.5%,亦明显高于NSC组的82.2±6.9%。10%FA组愈合时间为20.29±1.67天,与VC组(22.86±2.23天)相比,明显缩短了愈合时间;40mg FA组的愈合时间为20.57±1.84天,与NSC组(23.29±1.98天)相比,明显加快了创面的愈合速度。处理后11天,创面组织取材,并采用CD34免疫组化染色,统计各组创面的微血管密度(Micro-vessel Density,MVD),阿魏酸处理组与对照组相比,阳性细胞数目明显增多,管腔数目较多,结构也较完整,p0.05,有统计学差异。分别在常氧和缺氧条件下以不同浓度的阿魏酸处理HUVEC细胞。发现阿魏酸能不同程度的促进HUVEC细胞的增殖,在常氧状态下以1×10-4 mol/L的阿魏酸处理效果最好,而在缺氧条件下,阿魏酸浓度为1×10-5 mol/L时,细胞增殖最活跃,与对照组相比,有统计学差异。在常氧和缺氧状态下,当阿魏酸浓度为1×10-8~1×10-5mol/L时,阿魏酸可呈浓度依赖性地促进HUVEC细胞迁移和管腔样结构的形成,以1×10-5 mol/L阿魏酸处理的作用最好,与对照组相比,有统计学差异。在常氧和缺氧状态下,以1×10-5 mol/L的阿魏酸处理HUVEC细胞,Western blot检测发现PDGF、VEGF及HIF-1α蛋白的表达上调,在6h时蛋白的表达达到最大值,与对照组相比,有统计学差异。在常氧和缺氧状态下,用ERK1/2信号通路特异性抑制剂PD98059预处理HUVEC细胞30min后,再用1×10-5mol/L阿魏酸处理6h。Western blot检测发现,阻断了ERK1/2信号通路后,抑制了阿魏酸依赖的VEGF及PDGF蛋白表达的上调,甚至还有所降低,与对照组相比,p0.05,差异有统计学意义。结论在水中,阿魏酸能从以凡士林为基质的软膏中溶出;阿魏酸能加速糖尿病大鼠慢性创面的愈合,并能提高创面组织中的微血管密度;在常氧和缺氧条件下,阿魏酸能促进HUVEC细胞增殖、迁移和管腔样结构的形成;在常氧和缺氧条件下,阿魏酸能上调VEGF、PDGF及HIF-1α蛋白的表达,并且其调节VEGF及PDGF蛋白的表达与ERK1/2信号通路有关。
【关键词】：阿魏酸 慢性难愈性创面 糖尿病大鼠 人脐静脉内皮细胞 ERK1/2信号通路
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-14
• 文献回顾14-25
• 1 研究背景及意义14-15
• 2 慢性创面的血管化机制15-18
• 3 慢性创面的治疗方法18-23
• 4 阿魏酸与慢性创面愈合23-25
• 实验一 阿魏酸对糖尿病大鼠慢性创面愈合的影响25-42
• 1 材料25-26
• 2 方法26-32
• 3 结果32-39
• 4 讨论39-42
• 实验二 阿魏酸对HUVEC细胞血管生成的影响及其分子机制研究42-55
• 1 材料42-44
• 2 方法44-48
• 3 结果48-53
• 4 讨论53-55
• 小结55-57
• 参考文献57-65
• 个人简历和研究成果65-66
• 致谢66

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本文编号：704212