TNFAIP3在系统性红斑狼疮患者B细胞的作用初步研究

发布时间：2017-08-28 15:09

  本文关键词：TNFAIP3在系统性红斑狼疮患者B细胞的作用初步研究

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【摘要】：[研究背景]系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是可引起多系统、多器官损伤炎症的自身免疫性疾病,以T、B细胞免疫功能异常,产生多种自身抗体(如抗核抗体、抗dsDNA抗体、抗磷脂抗体)、发生引起浆膜炎、关节炎、血管炎肾小球肾炎等炎症损伤的自身免疫复合物为特点。病变涉及皮肤、黏膜、心脏、肾脏、肝脏和血液系统、神经系统等多个组织和器官。迄今为止,未有任何研究明确SLE的发病机制及病因,但经过多项研究证明SLE目前与环境(如强烈阳光)、激素、病毒感染、免疫、遗传、药物等多种因素有关。而综合各科研表明,SLE是一种呈非孟德尔遗传方式为主的多基因病,遗传因素在SLE诱导因素中占主要地位。近几年,多项候选基因研究及全基因组关联研究(Genome-wide association study, GWAS)已证实,在中国汉族SLE患者中,TNFAIP3为其易感基因之一。7NFAIP3可抑制Toll样受体(TLR)和肿瘤坏死因子(TNF)受体诱导的核因子kappa-B (NF-κB)活性以及TNF介导的程序性细胞死亡(PCD),最终抑制NF-κ-B的强度,终止NF-κB介导的促炎症反应,进而抑制B细胞的缺陷凋亡以及活化过度,可能在SLE等自身免疫性疾病的发病机制中起到重要作用。[目 的]1.构建出含TNFAIP3基因的重组逆转录病毒表达载体,并能在哺乳类动物中良好地高效表达。2、分别过表达SLE患者及正常对照者外周血B细胞TNFAIP3基因,检测过表达该基因对B细胞生长、存活及对其它基因TLR7、TLR9、BAFF-R表达的影响。通过本课题实验研究探讨TNFAIP3基因在SLE患者B细胞TLR7、TLR、BAFF-R潜在的关联,以及TNFAIP3对SLE疾病潜在的作用机制及其临床意义,为深度研究TNFAIP3基因在SLE的发病机制、病情加重因素中起到的生物学功能及免疫调节作用打下良好的基础,同时也能够为SLE病情活动提供新的诊断思路,也为SLE的治疗提供更好的途径。[方法]1.构建含TNFAIP3基因的逆转录病毒表达载体TNFAIP3-pBABEpuro。2.收集SLE患者30例及健康对照30例,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法并使用人外周血淋巴细胞分离液分离SLE患者及健康人外周血淋巴细胞,运用免疫磁珠分选方法分选CD19+ B淋巴细胞,待用。3、选用293T细胞来对TNFAIP3-pBABEpuro、pBABE进行慢病毒包装质粒,待培养48h后收集病毒上清液,并将其加入至盛有预先分选出的SLE患者及健康人的B淋巴细胞的培养板中,24h换液一次,待感染48h后收集细胞,从收集的B细胞中提取RNA,然后将RNA反转录为cDNA；最后使用Real-time PCR实时荧光定量PCR技术检测过表达TNFAIP3的SLE病人以及健康人B淋巴细胞中TNFAIP3其mRNA表达水平,B细胞中TLR7、TLR9、BAFF-R mRNA的表达情况；最后采用MTT法实验检测过表达TNFAIP3基因后B淋巴细胞存活的影响。[结果]1.成功构建了含TNFAIP3基因的重组逆转录病毒表达载体,并证实了其能在哺乳动物细胞中较高表达。2、分别过表达SLE患者及正常对照者B细胞TNFAIP3基因,均得出过表达质粒感染组(TNFAIP3-pBABE)较其对照组(pBABE), TNFAIP3 mRNA的表达明显增高,且具有显著性的差异(P0.01)。不管是过表达SLE患者,还是正常对照B细胞中TNFAIP3基因,均可使该基因在mRNA水平明显上调,且在SLE患者B细胞该基因上调更高。3、正常对照及SLE患者,过表达质粒感染组(TNFAIP3-pBABE)均较其对照组(pBABE),TLR7 mRNA的表达明显降低,且具有显著性的差异(P0.01)。且SLE患者TLR7表达下调的程度较正常对照更明显。4、正常对照及SLE患者,过表达质粒感染组(TNFAIP3-pBABE)均较其对照组(pBABE), TLR9 mRNA的表达明显升高,差异明显,具有统计学意义(P0.05)。与正常对照相比,过表达SLE患者B细胞TNFAIP3基因,其T LR9 mRNA表达上调更明显。5、外源性过表达外周血B细胞TNFAIP3基因,可使B细胞中TNFAIP3基因的表达上调,同时该基因的表达也影响了B细胞中BAFF-R mRNA表达,使其著显上调。6、过表达SLE患者及正常对照B细胞中TNFAIP3基因后,对B细胞的生长存活影响无明显影响。[结论]1. TNFAIP3异常表达提示该基因在SLE免疫发病机制中起着重要的调节作用。2TNFAIP3可能通过调节受体后信号通路转导影响TLR介导的信号途径、影响TLR、BAFF-R的表达。3.TNFAIP3基因不影响B细胞的生长、存活。[研究意义]该研究探讨TNFAIP3基因对SLE的发生、发展的影响,对SLE发病机制具有重要的研究指导意义,为SLE发病机制提供了理论依据。在应用上,为SLE的治疗提供新的靶点,进一步阐明了对SLE的在基因层面行治疗的可能性
【关键词】：红斑狼疮/系统性 B淋巴细胞 TNFAIP3 过表达
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R593.241
【目录】：

• 英文缩写词5-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-20
• 1. 系统性红斑狼疮概述13-16
• 2. TNFAWB基因概述16-17
• 3. NF-kB概述17-20
• 第一章 TNFAIP3-pBABEpuro逆转录病毒表达载体的构建及鉴定20-36
• 1.1 主要技术路线20
• 1.2 实验材料20-21
• 1.3 实验方法21-32
• 1.4 实验结果32-35
• 1.5 小结35-36
• 第二章 过表达TNFAIP3对SLE患者外周血B细胞的影响36-52
• 2.1 主要技术路线36
• 2.2 实验材料36-38
• 2.3 实验方法38-43
• 2.4 实验结果43-50
• 2.5 小结50-52
• 讨论52-59
• 结论59-60
• 实验不足之处60-61
• 参考文献61-68
• 综述68-76
• 参考文献73-76
• 攻读硕士学位期间发表的文章及科研项目情况76-77
• 致谢77-78

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7 郭颖P，

本文编号：748255