广西巴马小型猪HSL基因表达与2型糖尿病的相关性研究

发布时间：2017-09-06 02:20

  本文关键词：广西巴马小型猪HSL基因表达与2型糖尿病的相关性研究

  更多相关文章： 广西巴马小型猪 2型糖尿病 HSL基因 脂肪代谢 胰岛素

【摘要】：糖尿病作为严重危害人类健康的慢性非传染性疾病,其患病率呈逐年上升趋势,其中以2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)为主。脂代谢异常是诱发T2DM的重要因素之一。激素敏感性脂肪酶(Hormone sensitive lipase, HSL)是脂肪甘油三酯水解的关键酶和限速酶,在脂肪代谢过程中发挥了至关重要的作用。HSL在肥胖及胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)发生过程中有重要作用。但关于HSL在T2DM发生过程中的作用机制研究较少。本实验通过检测高脂高糖诱导的T2DM发病组、未发病组和正常饲喂的对照组的广西巴马小型猪脂肪组织和胰腺组织中HSL基因及其相关基因的表达水平,血清生化指标及胰岛素(Insulin, INS)水平,以及过表达HSL基因对3T3-L1细胞和pTC-6细胞的影响,从动物和细胞水平初步研究HSL在2型糖尿病发生中的作用途径。1.比较分析T2DM组(6头)、未发病组(6头)和对照组(4头)广西巴马小型猪的血清生化指标和胰岛素水平。结果表明,T2DM组的FBG和INS水平均显著高于对照组(P0.05),未发病组的TG、TC、HDL和LDL水平都显著高于对照组,T2DM组的TG和HDL水平显著低于未发病组。饲喂高脂高糖日粮能显著改变小型猪血清生化指标和胰岛素水平,有向T2DM方向发展的趋势。2.利用QRT-PCR技术检测实验组和对照组巴马小型猪的HSL基因及其相关基因(ATGL、MGL、LPL、FASN、PPARγ)的表达情况。结果显示,广西巴马小型猪的心、肝、脾、肾、胰、背最长肌、皮下脂肪组织中均检测到HSL基因表达,其中在皮下脂肪中HSL基因表达丰度最高。在皮下脂肪中,T2DM组的LPL基因表达水平显著高于未发病组和对照组,FASN基因的表达水平显著低于后两组,HSL基因表达水平显著低于未发病组,PPARy基因表达水平显著低于对照组。在胰腺组织中,T2DM组和未发病组的HSL和INS基因表达水平显著高于对照组,T2DM组INS基因表达水平显著高于未发病组。3.根据GenBank公布的猪HSL基因CDS序列设计引物,扩增广西巴马小型猪HSL基因CDS序列,进行生物信息学分析。结果显示,广西巴马小型猪HSL基因CDS序列长2295bp,与参考序列的同源性为99.9%；存在3处碱基的错义突变,1427 T→A引起HSL的第476位Leu→His,1801 A→G引起第601位Thr→Ala,1933 A→T引起第645位Arg→Trp。对广西巴马小型猪HSL的蛋白预测发现,HSL具有很强的疏水性,有高含量的α螺旋及无规则卷曲,较低含量的p折叠,具有7个跨膜结构域,这可能与HSL作为脂肪酶类有关。成功构建了PLV-HSL慢病毒表达载体,为后续细胞实验奠定了基础。4.在3T3-L1前体脂肪细胞和pTC-6细胞中过表达HSL基因。结果显示,将PLV-HSL重组慢病毒载体质粒和PLV空载质粒分别转染3T3-L1细胞,过表达HSL,可显著上调MGL基因表达。诱导3T3-L1细胞分化过程中,相对于PLV组,PLV-HSL组HSL、C/EBPα、MGL、LPL、aP2、ATGL、 FASN基因的相对表达水平呈协同变化趋势；从诱导分化后的第4天(Day4)起,PLV-HSL组细胞培养液中TG浓度显著低于PLV组。将PLV-HSL质粒和PLV质粒分别转染pTC-6细胞,HSL基因过表达,可刺激INS基因的表达。但是,PLV-HSL转染βTC-6细胞48h和72h,细胞培养液中INS浓度显著低于PLV组。在食物诱导广西巴马小型猪建立2型糖尿病模型过程中,高脂高糖日粮刺激脂肪合成关键基因(LPL)表达显著上调,抑制脂肪分解代谢相关基因(HSL)表达,引发机体肥胖和脂肪代谢障碍；高脂高糖日粮能刺激胰腺组织HSL基因的表达,显著上调INS基因表达,小型猪血清中胰岛素浓度增加,长时间维持高水平的血清胰岛素,引发胰岛素抵抗。脂肪代谢障碍和胰岛素抵抗是诱发T2DM发生的主要病因。研究结果表明,HSL在2型糖尿病发生中起着重要的调控作用。
【关键词】：广西巴马小型猪 2型糖尿病 HSL基因 脂肪代谢 胰岛素
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 缩写词中英文对照14-15
• 第一章 文献综述15-20
• 1.1 2型糖尿病的研究进展15
• 1.2 广西巴马小型猪2型糖尿病动物模型15-16
• 1.3 HSL基因简介16-17
• 1.4 HSL的生物学功能17-18
• 1.5 HSL与2型糖尿病的关系18-19
• 1.6 脂代谢相关基因功能简介19
• 1.7 本研究的目的意义19-20
• 第二章 广西巴马小型猪HSL及其相关基因的表达分析20-31
• 2.1 实验材料20-21
• 2.1.1 试验样品20
• 2.1.2 主要试剂20
• 2.1.3 主要仪器20-21
• 2.2 实验方法21-24
• 2.2.1 检测广西巴马小型猪血清的生化指标21
• 2.2.2 广西巴马小型猪组织总RNA的提取和cDNA合成21-23
• 2.2.3 实时荧光定量PCR检测HSL基因的表达23-24
• 2.2.4 数据统计分析24
• 2.3 实验结果与分析24-28
• 2.3.1 血清生理生化指标及胰岛素水平24-25
• 2.3.2 组织总RNA提取结果25-26
• 2.3.3 HSL基因的组织表达谱分析26
• 2.3.4 皮下脂HSL基因及脂肪代谢分化相关基因的相对表达结果26-27
• 2.3.5 胰腺组织HSL基因和INS基因的相对表达结果27-28
• 2.4 讨论28-30
• 2.5 小结30-31
• 第三章 广西巴马小型猪HSL基因的克隆、生物信息学分析及慢病毒载体的构建31-47
• 3.1 实验材料31-33
• 3.1.1 试验样品31
• 3.1.2 载体及菌株31
• 3.1.3 主要试剂及仪器31-32
• 3.1.4 试剂的配制32-33
• 3.2 实验方法33-37
• 3.2.1 广西巴马小型猪皮下脂总RNA反转录为cDNA33-34
• 3.2.2 引物的设计与合成34
• 3.2.3 PCR扩增HSL基因34
• 3.2.4 目的片段与pMD18-T载体连接34
• 3.2.5 pMD18-T-HSL重组质粒的转化34-35
• 3.2.6 pMD18-T-HSL重组质粒的鉴定35
• 3.2.7 广西巴马小型猪HSL基因的生物信息学分析35-36
• 3.2.8 pMD18-T-HSL重组质粒和慢病毒载体PLV的双酶切36
• 3.2.9 双酶切产物的胶回收纯化36
• 3.2.10 T4连接36-37
• 3.2.11 PLV-HSL重组慢病毒载体质粒的转化37
• 3.2.12 PLV-HSL重组慢病毒载体质粒的鉴定37
• 3.3 实验结果与分析37-45
• 3.3.1 PCR扩增HSL基因的结果37-38
• 3.3.2 pMD18-T-HSL重组质粒鉴定结果38-39
• 3.3.3 HSL基因的序列及生物信息学分析39-43
• 3.3.4 pMD18-T-HSL和PLV双酶切结果43-44
• 3.3.5 PLV-HSL重组质粒鉴定结果44-45
• 3.4 讨论45-46
• 3.5 小结46-47
• 第四章 过表达HSL对3T3-L1细胞和βTC-6细胞的影响47-62
• 4.1 实验材料47-48
• 4.1.1 细胞来源47
• 4.1.2 主要试剂47-48
• 4.1.3 实验仪器48
• 4.1.4 试剂的配制48
• 4.2 实验方法48-52
• 4.2.1 PLV-HSL和PLV去内毒素质粒的提取48
• 4.2.2 3T3-L1和βTC-6细胞的复苏、冻存与传代培养48-49
• 4.2.3 重组质粒转染3T3-L1和βTC-6细胞49-50
• 4.2.4 收集细胞提取总RNA反转录为cDNA50
• 4.2.5 实时荧光定量PCR50-51
• 4.2.6 检测转染3T3-L1细胞后培养基的TG含量51
• 4.2.7 ELISA检测转染βTC-6细胞后培养基的胰岛素浓度51-52
• 4.3 实验结果及分析52-58
• 4.3.1 去内毒素质粒的检测52
• 4.3.2 转染前细胞形态观察52
• 4.3.3 细胞转染结果52-54
• 4.3.4 转染3T3-L1细胞后诱导细胞分化结果54-55
• 4.3.5 转染3T3-L1细胞后各基因相对表达结果55-56
• 4.3.6 转染βTC-6细胞HSL基因和INS基因的相对表达结果56-57
• 4.3.7 3T3-L1细胞培养基的TG含量测定结果57-58
• 4.3.8 βTC-6细胞培养基的胰岛素浓度测定结果58
• 4.4 讨论58-60
• 4.5 小结60-62
• 结论62-63
• 参考文献63-69
• 附录69-73
• 致谢73-74
• 攻读学位期间发表的学术论文74

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本文编号：801594