Betatrophin重组腺病毒过表达载体的构建

发布时间：2017-09-09 16:11

  本文关键词：Betatrophin重组腺病毒过表达载体的构建

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【摘要】：目的应用基因同源重组技术,构建表达小鼠Betatrophin基因的复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步研究Betatrophin的功能奠定基础。方法根据GenBank中小鼠Betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)序列,经化学合成得到含BamH I/Age I酶切位点的小鼠Betatrophin基因全长c DNA质粒,将其酶切后插入到带有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的GV314载体CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP中,得到重组病毒穿梭质粒pGV314-Betatrophin。利用Ad-Max包装系统,此重组穿梭质粒与病毒基因组质粒pBHG loxΔE1,3 Cre体外同源重组构建含有目的基因的腺病毒载体Ad-Betatrophin,纯化后转染HEK293T细胞包装重组病毒颗粒,经在HEK293T细胞反复扩增数代后,利用聚合酶链式反应(PCR)、免疫印迹法(western blot)及测序来鉴定重组的腺病毒。结果(1)目的基因Betatrophin经化学合成后双酶切鉴定大小符合。(2)将双酶切后的质粒pcDNA3.1-Betatrophin和载体pGV314利用In-fusion克隆技术,得到交换产物,即pGV314-Betatrophin重组穿梭质粒,经PCR、western blot及测序检测表明腺病毒穿梭质粒构建成功。(3)病毒穿梭质粒pGV314-Betatrophin和病毒基因组质粒pBHG loxΔE1,3Cre经在293T细胞中成功包装出重组腺病毒质粒pAd-Betatrophin。(4)重组腺病毒pAd-Betatrophin转染293T后成功包装出腺病毒,经扩增、纯化获得的病毒滴度为1×1010.2pfu/ml。结论成功构建了携带小鼠Betatrophin基因的重组穿梭质粒,并且转染293T细胞后成功包装出重组腺病毒Ad-Betatrophin,这有助于进一步研究Betatrophin的功能。
【关键词】：Betatrophin 腺病毒载体 同源重组
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 英文缩写索引8-12
• 第一章 绪论12-18
• 1.1 前言12-13
• 1.2 论文研究目的、实验方法、实验方案的选择和临床意义13-18
• 1.2.1 研究目的13
• 1.2.2 研究主要内容和方法13-15
• 1.2.3 实验方案的设计15-16
• 1.2.4 研究的临床意义16-18
• 第二章 pGV314-betatrophin重组穿梭质粒的构建及鉴定18-40
• 2.1 试剂与仪器18-19
• 2.1.1 仪器18
• 2.1.2 药品与试剂18-19
• 2.2 实验溶液的配置19-22
• 2.3 实验方法22-31
• 2.3.1 含有小鼠Betatrophin基因质粒的构建22-24
• 2.3.2 穿梭质粒pGV314酶切线性化24-26
• 2.3.3 目的基因连接于线性化载体pGV31426
• 2.3.4 交换产物转化大肠杆菌感受态细胞26-27
• 2.3.5 用于阳性克隆鉴定的PCR引物设计27
• 2.3.6 pGV314-Betatrophin穿梭载体的鉴定27-28
• 2.3.7 HEK293T细胞的培养28
• 2.3.8 外源基因表达的鉴定28-31
• 2.4 结果31-35
• 2.4.1 带有目的基因的pcDNA3.1 质粒的鉴定31
• 2.4.2 重组穿梭质粒pGV314-Betatrophin的鉴定31-32
• 2.4.3 重组质粒Ad-Betatrophin蛋白表达检测32-33
• 2.4.4 阳性克隆DNA测序结果及结果分析33-34
• 2.4.5 用于阳性克隆鉴定的PCR引物设计34-35
• 2.5 讨论35-39
• 2.6 结论39-40
• 第三章 重组腺病毒Ad-Betatrophin的构建及鉴定40-47
• 3.1 试剂与仪器40
• 3.1.1 仪器40
• 3.1.2 药品与试剂40
• 3.2 实验方法40-43
• 3.2.1 pGV314穿梭质粒的抽提40-41
• 3.2.2 腺病毒质粒的获取41
• 3.2.3 人胚肾 293T细胞的培养41
• 3.2.4 重组腺病毒的包装、扩增、纯化41-43
• 3.2.5 腺病毒滴度测定-终点稀释法43
• 3.3 结果43-44
• 3.3.1 重组腺病毒的收获43-44
• 3.3.2 病毒滴度测定44
• 3.4 讨论44-46
• 3.5 结论46-47
• 展望47-48
• 参考文献48-52
• 综述52-65
• 参考文献60-65
• 致谢65-67
• 攻读硕士期间发表文章67-68
• 附录68

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本文编号：821437