鸦胆子苦醇对类风湿关节炎滑膜细胞增殖、凋亡和运动能力调控的研究

发布时间：2017-09-10 04:39

  本文关键词：鸦胆子苦醇对类风湿关节炎滑膜细胞增殖、凋亡和运动能力调控的研究

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【摘要】：类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以滑膜炎为主要特征的慢性自身免疫性疾病,能够侵犯全身各处的关节,呈现多发性和对称性。RA的病理情况主要表现为滑膜增生、软骨和骨的破坏、大量炎性细胞浸润以及微血管的新生。RA能够引起关节的疼痛和僵硬,甚至对关节进行严重的破坏。RA的病发原因复杂多样并涉及淋巴细胞、滑膜细胞、软骨细胞等多种细胞类型,其中类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(Rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA FLS)作为一种“类肿瘤样”细胞,在RA的发生和发展中起到了非常关键的作用。一方面,RA FLS的过度增殖和异常的凋亡能够造成滑膜增厚,在炎症反应和关节破坏中发挥作用。另一方面,RA FLS表现出异常的迁移和侵袭能力,产生蛋白水解酶等对细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)进行降解并造成软骨和骨的破坏进而导致关节畸形甚至关节功能丧失。鸦胆子苦醇(Brusatol)是近几年肿瘤相关研究中表现出良好抑癌作用的潜力药物,其能够有效地抑制肿瘤的形成和生长,具有良好的抗炎症作用,并且在我国的中医药的运用中鸦胆子苦醇也取得了满意的效果。作为“类肿瘤样”细胞的RA FLS在其细胞学行为方面与肿瘤细胞有着相似的特点,因此在本课题中,我们把鸦胆子苦醇首次运用到RA的研究中,来探究鸦胆子苦醇对RA FLS的影响并进行相关机制的探索。本课题中采用细胞生物学、分子生物学和生物力学等技术手段与方法,探究鸦胆子苦醇对RA FLS的增殖、凋亡、迁移、侵袭和力学性质的影响,并对相关机制进行初步探索。主要工作和结论如下:(1)采用组织块培养法分离提取RA FLS,采用结晶紫染色方法和细胞骨架染色方法对细胞进行形态观察,采用Western blotting方法检测细胞中RA的标志物CHI3L1的表达情况。结果表明,细胞传代至第3代便可得到形态均一的呈梭形的成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS),并且卵圆形的细胞核位于细胞中央,细胞具有伪足结构。与人正常成纤维样滑膜细胞相比,分离提取的细胞中CHI3L1显著性增加。提示采用组织块培养法获得了呈梭形的RA FLS。(2)采用MTS方法、EdU方法和Western blotting方法检测鸦胆子苦醇对RA FLS的毒性、增殖和凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-8的影响。结果发现,在本课题中鸦胆子苦醇所采用的浓度范围(0~80nM)内,鸦胆子苦醇对RA FLS没有毒性。鸦胆子苦醇能够抑制RA FLS的增殖并且可以上调Caspase-3和Caspase-8的表达,促进RA FLS的凋亡。(3)采用Transwell细胞小室方法、细胞骨架染色方法和原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)方法检测鸦胆子苦醇对细胞的迁移、侵袭、细胞骨架和细胞力学性质的影响。结果发现,鸦胆子苦醇能够抑制RA FLS的迁移和侵袭行为。鸦胆子苦醇能够降低RA FLS板状伪足和丝状伪足的产生,降低RA FLS的运动能力。鸦胆子苦醇增加RA FLS的杨氏模量,提高细胞的硬度,降低细胞的变形和运动能力。(4)采用Western blotting方法、实时定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)方法、酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法和酶谱方法检测鸦胆子苦醇对与调控细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等相关联的转录因子Nrf2、pERK、CHI3L1、MMPs、N-WASP、肌动蛋白结合蛋白和整合素表达的影响。结果发现,鸦胆子苦醇能够上调Nrf2的表达,抑制ERK的磷酸化水平,下调CHI3L1、MMPs、N-WASP、肌动蛋白结合蛋白和整合素的表达。综上所述,本课题研究表明,鸦胆子苦醇可抑制RA FLS的增殖、促进RA FLS的凋亡并且抑制RA FLS的迁移、侵袭和变形与运动能力,这与鸦胆子苦醇调节与细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等细胞行为相关的Nrf2、pERK、MMPs、CHI3L1、N-WASP、肌动蛋白结合蛋白和整合素有一定联系,提示鸦胆子苦醇在RA的缓解和治疗方面具有良好的应用前景和价值。
【关键词】：类风湿关节炎 鸦胆子苦醇 增殖 凋亡 运动能力
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R593.22
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-10
• 缩略词表10-11
• 1 绪论11-17
• 1.1 问题的提出和研究意义11-14
• 1.1.1 类风湿关节炎11-12
• 1.1.2 滑膜组织的生理学和病理学情况12
• 1.1.3 RA中的FLS的情况12-13
• 1.1.4 鸦胆子苦醇13-14
• 1.2 研究的目的和内容14-17
• 2 人成纤维样滑膜细胞的分离培养和观察17-29
• 2.1 引言17
• 2.2 实验材料17-22
• 2.2.1 实验细胞17-18
• 2.2.2 主要材料和仪器设备18-19
• 2.2.3 主要试剂19-20
• 2.2.4 主要试剂配制方法20-22
• 2.3 实验方法22-25
• 2.3.1 成纤维样滑膜细胞的原代分离和培养22-23
• 2.3.2 结晶紫染色实验检测RA FLS形态23-24
• 2.3.3 细胞骨架染色实验检测RA FLS细胞骨架24
• 2.3.4 Western blotting实验检测RA FLS标志物的表达24-25
• 2.4 实验结果25-28
• 2.4.1 成纤维样滑膜细胞的原代分离和培养25-26
• 2.4.2 RA FLS结晶紫染色和细胞骨架染色26-27
• 2.4.3 RA FLS标志物的检测27-28
• 2.5 讨论28
• 2.6 本章小结28-29
• 3 鸦胆子苦醇对RA FLS增殖和凋亡的影响29-39
• 3.1 引言29
• 3.2 实验材料29-31
• 3.2.1 实验细胞29
• 3.2.2 主要材料和仪器设备29-30
• 3.2.3 主要试剂30
• 3.2.4 主要试剂配制方法30-31
• 3.3 实验方法31-34
• 3.3.1 MTS实验检测鸦胆子苦醇对细胞毒性的影响31
• 3.3.2 EdU细胞增殖实验检测细胞增殖31-32
• 3.3.3 Western blotting实验检测细胞中蛋白表达32-34
• 3.4 实验结果34-37
• 3.4.1 鸦胆子苦醇对细胞毒性的影响34
• 3.4.2 鸦胆子苦醇对细胞增殖的影响34-35
• 3.4.3 鸦胆子苦醇对细胞凋亡的影响35-37
• 3.5 讨论37-38
• 3.6 本章小结38-39
• 4 鸦胆子苦醇对RA FLS运动能力的影响39-49
• 4.1 引言39
• 4.2 实验材料39-41
• 4.2.1 实验细胞39
• 4.2.2 主要材料和仪器设备39-40
• 4.2.3 主要试剂40-41
• 4.2.4 主要试剂配制方法41
• 4.3 实验方法41-43
• 4.3.1 Transwell细胞小室实验检测细胞迁移41
• 4.3.2 Transwell细胞小室实验检测细胞侵袭41-42
• 4.3.3 细胞骨架荧光染色实验检测细胞骨架42-43
• 4.3.4 AFM实验检测细胞杨氏模量43
• 4.4 实验结果43-46
• 4.4.1 鸦胆子苦醇对细胞迁移的影响43-44
• 4.4.2 鸦胆子苦醇对细胞侵袭的影响44-45
• 4.4.3 鸦胆子苦醇对细胞骨架的影响45
• 4.4.4 鸦胆子苦醇对细胞杨氏模量的影响45-46
• 4.5 讨论46-47
• 4.6 本章小结47-49
• 5 鸦胆子苦醇对RA FLS细胞行为影响的机制探索49-75
• 5.1 引言49-51
• 5.2 实验材料51-54
• 5.2.1 实验细胞51
• 5.2.2 主要材料和仪器设备51-52
• 5.2.3 主要试剂52-53
• 5.2.4 主要试剂配制方法53-54
• 5.3 实验方法54-64
• 5.3.1 Western blotting实验检测蛋白表达54-57
• 5.3.2 酶谱实验检测MMP-2 表达57-59
• 5.3.3 qPCR实验检测基因表达59-62
• 5.3.4 ELISA实验检测MMP-1 表达62-64
• 5.4 实验结果64-72
• 5.4.1 鸦胆子苦醇对Nrf2表达的影响64-65
• 5.4.2 鸦胆子苦醇对pERK表达的影响65-66
• 5.4.3 鸦胆子苦醇对MMP-1 表达的影响66-68
• 5.4.4 鸦胆子苦醇对MMP-2 表达的影响68-70
• 5.4.5 鸦胆子苦醇对MMP-3 表达的影响70-71
• 5.4.6 鸦胆子苦醇对CHI3L1表达的影响71-72
• 5.4.7 鸦胆子苦醇对N-WASP、肌动蛋白结合蛋白和整合素表达的影响72
• 5.5 讨论72-74
• 5.6 本章小结74-75
• 6 结论与展望75-77
• 6.1 主要结论75-76
• 6.2 工作展望76-77
• 致谢77-79
• 参考文献79-85
• 附录 作者在攻读硕士学位期间发表的论文85

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 刘楠楠;赵薇;穆楠;田菲;薛晓畅;颜真;张伟;;类风湿性关节炎成纤维样滑膜(FLS)细胞中DDR2相互作用分子的筛选鉴定及其对FLS细胞侵袭能力的影响[J];生物技术通讯;2015年03期

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6 李茹,栗占国;类风湿关节炎抗原的研究进展[J];中华风湿病学杂志;2004年02期

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本文编号：824790