TNF-α对SD大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响及相关分子机制的探讨

发布时间：2017-09-13 07:42

  本文关键词：TNF-α对SD大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响及相关分子机制的探讨

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【摘要】：目的:通过探讨炎症因子TNF-α对SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成脂分化的影响及相关的分子机制,为临床治疗和预防肥胖相关代谢性疾病提供理论基础。方法:(1)采用全骨髓细胞贴壁法分离、纯化和培养SD大鼠BMSCs。(2)使用生长良好的第3代(P3)SD大鼠BMSCs进行成脂、成骨分化诱导,鉴定BMSCs多向分化的能力;流式细胞术检测BMSCs表面标志物CD90、CD44、CD45、CD29、CD11b的表达。(3)MTT法检测不同浓度TNF-α(1、10、20、50、100ng/ml)在不同培养时间(24h、48h、72h)对BMSCs增殖的影响;油红O染色及异丙醇萃取后检测OD值观察不同浓度TNF-α(1、10、20、50、100ng/ml)对SD大鼠BMSCs成脂分化的影响。(4)将SD大鼠BMSCs分为对照组(Con组)、成脂诱导组(Ad组)和10ng/mL TNF-α干预成脂诱导组(Ad+TNFα组),分别于培养的第3、7、14天收集各组的细胞RNA,RT-PCR检测各组基因wnt10b、前体脂肪细胞因子-1(Preadipocytes factor-1,Pref-1)、CCAAT区增强子结合蛋白-α(CCAAT/enhancer-binding protein-α,C/EBP-α)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ)、脂肪酸结合蛋白-4(fattyacidbindingprotein-4,fabp-4)的mrna在不同培养时间下的表达水平。(5)于第14天收集3组细胞总蛋白,westernblot检测细胞中β-catenin、ppar-γ、c/ebp-α、fabp-4的蛋白表达水平。结果:(1)全骨髓贴壁法分离、纯化和培养的细胞为长梭形,核大,核仁2-3个,清晰可见,呈典型的漩涡状生长;具有成骨、成脂分化潜能,流式细胞术鉴定发现,细胞阳性表达cd29、cd90、cd44,阴性表达cd45、cd11b。(2)mtt结果显示,tnf-α对sd大鼠bmscs增殖的抑制作用呈时间-剂量依赖关系。从培养的第48h开始,相同时间下,细胞增殖率与tnf-α浓度呈负相关;相同浓度下,细胞增殖率与培养时间呈反比。随着培养时间的延长,较高浓度(20-100ng/ml)的tnf-α对bmscs增殖率抑制的影响无明显的统计学差异(p0.05)。(3)油红o染色和od值结果显示,tnf-α可以抑制bmscs的脂肪分化,该抑制作用与浓度呈正相关。(4)rt-pcr结果显示,在ad+tnfα组,随着时间的延长,wnt10b、pref-1的mrna水平明显增加并高于con组和ad组(p0.05),而c/ebp-α、ppar-γ、fabp-4的mrna水平则显著低于ad组。westernblot结果显示,诱导14天后,ad+tnfα组c/ebp-α、ppar-γ、fabp-4的蛋白水平明显低于ad组(p0.05)。磷酸化的β-catenin(p-β-catenin)蛋白水平也显著低于ad组(p0.05)。结论:(1)多向分化功能鉴定和流式细胞鉴定结果可知,实验中分离、纯化和培养的细胞为骨髓间充质干细胞。(2)tnf-α对sd大鼠bmscs增殖的抑制作用呈时间-浓度依赖关系;tnf-α可以抑制sd大鼠BMSCs的脂肪分化,该抑制作用与其浓度呈正相关。(3)TNF-α通过激活wnt/β-catenin信号通路,抑制成脂关键转录因子C/EBP-α、PPAR-γ的表达,发挥对SD大鼠BMSC成脂过程的抑制作用。而TNF-α促进Pref-1表达又提示我们,TNF-α的抑制效应可能只作用于分化相,而对决定相没有影响。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 成脂分化 炎症因子 wnt/β-catenin信号通路 Pref-1
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R589
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-13
• 实验一 SD大鼠BMSCs的分离培养与鉴定13-22
• 1 材料和方法13-19
• 2 结果19-21
• 3 讨论21-22
• 实验二 不同浓度TNF-α 对BMSCs细胞增殖和成脂分化的影响22-28
• 1 材料和方法22-25
• 2 结果25-27
• 3 讨论27-28
• 实验三 TNF-α 对SD大鼠BMSCs成脂相关基因的表达和wnt/β-catenin信号通路的影响28-39
• 1 材料和方法28-35
• 2 结果35-37
• 3 讨论37-39
• 全文总结39-40
• 参考文献40-43
• 文献综述43-54
• 参考文献49-54
• 致谢54-55
• 攻读硕士学位期间发表的论文55

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本文编号：842423