类风湿关节炎患者关节成纤维样滑膜细胞差异表达lncRNAs检测及初步生物信息学分析

发布时间：2017-09-14 00:22

  本文关键词：类风湿关节炎患者关节成纤维样滑膜细胞差异表达lncRNAs检测及初步生物信息学分析

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【摘要】：目的:长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)作为介导基因表达调控的功能性RNA分子,参与机体多种生理和病理过程。然而,有关lncRNA分子在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)中的功能和作用机制尚未见报道。本文通过分析研究RA患者和外伤患者关节FLSs中差异表达的lncRNAs,初步探索lncRNAs在RA发生发展中的作用。方法:取手术切取的3例RA患者和3例外伤患者的膝关节滑膜组织,原代培养滑膜FLSs至第3代。用Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0对FLSs中的lncRNAs和mRNAs进行检测,筛选出差异表达的lncRNAs和mRNAs(差异倍数2,P0.05)。对转录差异表达mRNAs的基因进行基因本体和信号通路分析。随后用实时荧光定量PCR扩大样本量验证可能与RA发病机制有关的差异表达mRNAs和lncRNAs。分析差异表达的lncRNAs与RA相关的实验室指标和疾病活动性指数之间的关系。进行受试者工作特征曲线(ROC)分析,评估差异表达的lncRNAs对RA的诊断价值。采用Cytoscape软件构建mRNA-lncRNA共表达分析网络,分析预测差异表达的lncRNAs功能和致病机制。结果:1.芯片结果显示,与对照组(CON-FLSs)相比,RA-FLSs中共发现有135条lncRNAs差异表达,其中62条上调,73条下调;103条mRNAs差异表达,其中36条表达上调,67条表达下调。2.定量PCR验证结果显示,与CON-FLSs相比,RA-FLSs中ENST00000483588表达上调,ENST00000438399、uc004afb.1和ENST00000452247表达下调,和芯片结果一致。3.ENST00000483588、ENST00000438399、uc004afb.1和ENST00000452247的ROC曲线下面积分别为0.85,0.92,0.97和0.92,提示这些差异表达的lncRNAs可能对RA有一定的诊断价值。此外,在RA患者中,ENST00000483588的表达水平与C-反应蛋白(CRP)水平和简化的疾病活性指数(SDAI)得分呈正相关。4.lncRNA-mRNA共表达分析结果显示ENST00000483588、ENST00000438399、uc004afb.1和ENST00000452247分别和9、9、8和12个mRNAs有较一致的表达模式。5.基因本体分析结果显示,上调的mRNAs参与了373个生物学过程,15个细胞组成成分,34个分子功能;下调的mRNAs参与了129个生物学过程,17个细胞组成成分,20个分子功能。信号通路分析结果显示,上调的mRNAs参与了9条信号通路,下调的mRNA参与了27条信号通路。结论:1.与对照组相比,RA-FLSs中lncRNAs表达谱发生了显著变化,其中ENST00000483588表达上调,ENST00000438399、uc004afb.1和ENST00000452247表达下调。ENST00000483588表达水平与疾病活动性指标CRP水平及SDAI得分呈正相关关系,可能对诊断和评估RA疾病活动性有潜在的价值。2.生物信息学分析结果显示,RA-FLSs中差异表达的编码基因参与了雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、低氧诱导因子(HIF-1)、细胞凋亡等信号通路,涉及了细胞生长迁移、白细胞激活分化、血管通透性改变等生物学过程;RA-FLSs差异表达的lncRNAs可能参与了RA-FLSs增殖、凋亡平衡失调及骨形成修复异常等过程。
【关键词】：类风湿关节炎 成纤维样滑膜细胞 长链非编码RNA 芯片
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R593.22
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 主要英文缩略词索引13-14
• 第一章 绪论14-24
• 1.1 类风湿关节炎概论14-17
• 1.1.1 RA的发病机制14-16
• 1.1.2 诊断标准进展16
• 1.1.3 RA缓解指标进展16-17
• 1.2 长链非编码RNA概论17-20
• 1.3 lncRNA与免疫细胞及风湿性疾病的关系20-24
• 1.3.1 lncRNA在免疫细胞中的作用21-22
• 1.3.2 lncRNA在风湿性疾病中的作用22-24
• 第二章 FLSs原代培养及鉴定24-32
• 2.1 研究目的24
• 2.2 实验材料24-26
• 2.2.1 研究对象和标本收集24
• 2.2.2 主要试剂和耗材24-25
• 2.2.3 实验试剂配制25
• 2.2.4 实验仪器25-26
• 2.3 实验方法26-28
• 2.3.1 FLSs原代培养26-28
• 2.3.2 流式细胞术鉴定FLSs纯度28
• 2.4 实验结果28-30
• 2.4.1 原代培养细胞28-29
• 2.4.2 流式细胞术鉴定FLSs细胞纯度29-30
• 2.5 讨论30-32
• 第三章 RA患者FLSs长链非编码RNA检测分析32-48
• 3.1 研究目的32
• 3.2 材料32-34
• 3.2.1 研究对象32
• 3.2.2 主要试剂和耗材32-33
• 3.2.3 试剂配制33
• 3.2.4 实验仪器33-34
• 3.3 实验方法34-39
• 3.3.1 RNA提取34
• 3.3.2 总RNA纯化34-35
• 3.3.3 RNA质量检测35
• 3.3.4 逆转录和标记反应35-36
• 3.3.5 RNA纯化及cRNA质量检测36-37
• 3.3.6 杂交37-38
• 3.3.7 芯片洗涤38
• 3.3.8 数据提取38-39
• 3.4 实验结果39-46
• 3.4.1 总RNA提取结果39-40
• 3.4.2 芯片结果火山图分析40-41
• 3.4.3 差异表达的lncRNAs和mRNAs41-46
• 3.4.4 聚类分析46
• 3.5 讨论46-48
• 第四章 差异表达lncRNA的验证及其与临床指标相关性分析48-64
• 4.1 研究目的48
• 4.2 实验材料48-50
• 4.2.1 研究对象48-49
• 4.2.2 主要试剂和耗材49
• 4.2.3 试剂配制49
• 4.2.4 实验仪器49-50
• 4.3 实验方法50-52
• 4.3.1 RNA提取50
• 4.3.2 总RNA纯化50
• 4.3.3 RNA质量检测50
• 4.3.4 lncRNA分类50
• 4.3.5 实时定量PCR50-51
• 4.3.6 实验室指标及疾病活动性指标51-52
• 4.3.7 lncRNA-mRNA共表达分析52
• 4.3.8 统计学分析52
• 4.4 实验结果52-61
• 4.4.1 lncRNAs分类52-53
• 4.4.2 定量PCR结果53-55
• 4.4.3 相关性分析55-56
• 4.4.4 ROC曲线分析56
• 4.4.5 lncRNA-mRNA共表达分析56-61
• 4.5 讨论61-64
• 第五章 差异表达基因的初步生物信息学分析及验证64-75
• 5.1 研究目的64
• 5.2 材料64-65
• 5.2.1 研究对象64
• 5.2.2 主要试剂和耗材64
• 5.2.3 试剂配制64
• 5.2.4 实验仪器64-65
• 5.3 实验方法65-67
• 5.3.1 RNA提取65
• 5.3.2 总RNA纯化65
• 5.3.3 RNA质量检测65
• 5.3.4 信号通路分析65
• 5.3.5 基因本体分析65
• 5.3.6 实时定量PCR65-66
• 5.3.7 统计学分析66-67
• 5.4 实验结果67-73
• 5.4.1 RA-FLSs mRNA表达谱67
• 5.4.2 信号通路（pathway）分析67-68
• 5.4.3 基因本体（GO）分析68-72
• 5.4.4 细胞定量PCR结果72-73
• 5.5 讨论73-75
• 第六章 主要结论75-76
• 参考文献76-80
• 攻读硕士学位期间发表文章80-81
• 致谢81

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