兔抗小鼠TSPAN33抗体的制备及其在STZ诱导小鼠糖尿病模型中的作用研究
本文关键词：兔抗小鼠TSPAN33抗体的制备及其在STZ诱导小鼠糖尿病模型中的作用研究
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【摘要】：背景及目的：TSPAN33是四跨膜蛋白超家族成员。有报道其高表达于许多自身免疫病患者活化的B细胞表面,而在T细胞、NK细胞以及静息状态的B细胞中不表达或低表达。尤其在系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)及非霍奇金淋巴瘤患者的B细胞表面高表达TSPAN33,因此上述特性可作为这些疾病临床诊疗的标志物。而在自身免疫性糖尿病的B细胞表面TSPAN33是否表达及其意义迄今仍未知,因此本课题拟围绕B细胞表面TSPAN33蛋白能否作为免疫治疗靶点进行初步探讨。方法：1、小鼠TSPAN33基因的克隆、表达及纯化：用Trizol法从小鼠PBMC中提取总RNA。逆转录为cDNA后通过PCR扩增获得TSPAN33基因,并将其重组到pET-28a质粒中；将重组质粒pET28a/TSPAN33转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达后用Ni2+-NTA凝胶柱进行亲和层析纯化,并用含200 mmol/L咪唑的缓冲液进行洗脱纯化,行SDS-PAGE电泳分析鉴定；2、兔抗小鼠TSPAN33抗体的制备、纯化及鉴定：使用500μg/mL,200μL纯化后的蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫新西兰白兔,并分别3、7、14、24和48天分别加强免疫1次,在第60天获取兔抗鼠TSPAN33多克隆抗体,通过由磁珠耦联合成的多肽片段纯化得到抗体,用Western blot检测制备抗体的特异性和ELISA检测抗体效价；3、STZ诱导ICR小鼠糖尿病模型小鼠：将12只ICR小鼠采用连续5天腹腔注射6 mg/mL的STZ方式,以每只每次0.2 mL注射建模,诱导ICR小鼠发生糖尿病,测定小鼠血糖、胰岛素、胰岛素抗体等相关指标；4、STZ诱导组与正常组小鼠血细胞中TSPAN33+B细胞比例检测：从STZ诱导鼠和正常鼠中获得外周血,流式细胞术分别检测正常ICR小鼠和STZ诱导小鼠外周血细胞中TSPAN33+B细胞比例；5、抗TSPAN33抗体清除小鼠TSPAN33+B细胞：调整纯化抗体浓度至300μg/mL,给予小鼠尾静脉注射兔抗TSPAN33多抗100μL,连续监测正常及STZ诱导组小鼠TSPAN33+B细胞的比例；以及血清中胰岛素和胰岛素抗体水平；6、TSPAN33抗体通过B淋巴细胞影响MIN6细胞胰岛素基因表达：以免疫磁珠分选正常ICR和STZ诱导的ICR小鼠B淋巴细胞,流式细胞仪检测获得纯度；将分选的的B淋巴细胞分别与小鼠胰岛瘤MIN6细胞共培养,以MIN6细胞为空白对照孔,其余对应孔中加入10μL300μg/mL的抗TSPAN33抗体,通过qRT-PCR分别检测MIN6细胞胰岛素基因的表达。结果：1、TSPAN 33基因经RT-PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳后,在约852bp处可见一条特异性条带,测序结果显示与预期扩增的目的基因片段大小相符且无突变。将重组后的表达质粒pET28a/TSPAN33转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后并纯化得到TSPAN33蛋白。2、以免疫60天后的血清,经过超滤浓缩及磁珠耦联多肽纯化,将纯化后抗体经ELISA进行效价测定,发现纯化后的兔抗鼠TSPAN33抗体效价为1：64000。3、通过对STZ诱导ICR小鼠的糖尿病指标的监测表明,表明已成功诱导了ICR小鼠的自身免疫性糖尿病模型；4、流式细胞检测ICR小鼠外周血B细胞表面TSPAN33的表达,结果显示STZ诱导组小鼠TSPAN33+B细胞比例为(4.93±0.49)%高于对照组(1.82±0.19)%(***p0.001),且与人的检测结果相似；5、使用兔抗鼠TSPAN33抗体浓度(300μg/mL),以每只小鼠注射100μl的量清除STZ诱导组小鼠外周血中TSPAN33+B细胞,结果显示抗体删除组小鼠较未处理组小鼠血清胰岛素含量升高(**p0.01),而血清中IAA含量降低(**p0.01)。6、STZ诱导组小鼠B细胞与MIN6细胞共培养,使用抗TSPAN33抗体处理组胰岛素基因表达较未处理组显著升高(*p0.05)。结论：本研究中,我们成功制备并纯化出了较高效价的兔抗鼠TSPAN 33的多克隆抗体并以STZ成功诱导自身免疫性糖尿病小鼠模型。并且我们利用制备的抗体,通过减少模型小鼠外周血中TSPAN 33+B细胞比例,扭转模型自身免疫型糖尿病小鼠糖尿病各项指标。而且体外细胞实验证实,制备的多克隆抗体能够通过降低TSPAN33+B淋巴细胞对MIN6细胞的影响,从而增加胰岛素基因的表达。综上所述TSPAN33+B细胞有望作为人类自身免疫病治疗的靶点。
【关键词】：跨膜四蛋白33 I型糖尿病 B细胞 链脲佐菌素
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1;R-332
【目录】：
- 中英文缩略词表5-6
- 中文摘要6-9
- Abstract9-12
- 1 前言12-15
- 2 实验设计及流程15-16
- 3 实验材料16-21
- 4 实验方法21-30
- 5 结果30-42
- 6 讨论42-43
- 7 结论43-44
- 8 参考文献44-49
- 附录49-50
- 致谢50-51
- 综述51-61
- 参考文献57-61
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