雌激素调控破骨细胞TRPV5表达的分子机制研究

发布时间：2017-09-16 01:32

  本文关键词：雌激素调控破骨细胞TRPV5表达的分子机制研究

  更多相关文章： TRPV5 雌激素 破骨细胞 AP-1 SP1 NF-κB

【摘要】：目的:1.雌激素(E2)激活破骨细胞TRPV5基因启动子转录活性区域的确定。2.AP-1、SP1和NF-κB介导E2调控破骨细胞TRPV5的表达。方法:1.通过PCR获得TRPV5基因包含5’UTR及其上游启动子区域特定大小的片段,分别为2000bp,1000bp,500bp和150bp,连入p GL3-basic质粒,构建受小鼠TRPV5基因启动子驱动的荧光素酶报告基因质粒Trpv5-2k-luci,Trpv5-1k-luci,Trpv5-500-luci和Trpv5-150-luci,通过脂质体转染的方式,转染Raw264.7细胞,分析E2刺激前后的荧光素酶表达活性,寻找出受雌激素调控的TRPV5基因转录激活作用最强的区域。2.构建AP-1、SP1和NF-κB的RNAi载体,将AP-1、SP1和NF-κB的RNAi载体分别与Trpv5-500-luci质粒共转染Raw264.7细胞,对转染后细胞进行诱导分化,予以E2刺激。(1)观察E2刺激后Raw264.7细胞双荧光素酶活性变化情况。(2)应用Real-time PCR技术,检测E2刺激后Raw264.7细胞TRPV5基因的转录表达情况。(3)在沉默了NF-κB实验组中应用Western-blot,检测E2刺激后Raw264.7细胞中TRPV5基因的蛋白表达情况。(4)在沉默了NF-κB实验组中应用Ch IP技术,检测E2刺激后Raw264.7细胞中TRPV5基因的免疫沉淀表达量。结果:1.E2刺激后,转染了荧光素酶报告基因质粒Trpv5-2k-luci,Trpv5-1k-luci,Trpv5-500-luci和Trpv5-150-luci后的RAW264.7细胞,都有较明显的荧光素酶活性表达。统计学分析显示:转染了Trpv5-2k-lucia,Trpv5-1k-lucib以及Trpv5-500-lucic的Raw264.7细胞荧光素酶活性明显高于对照组,差异具有统计学意义(a:p=0.011,b:p=0.005,c:p=0.002)。转染了Trpv5-150-lucid的Raw264.7细胞荧光酶素酶活性与对照组相比也有所升高,但无统计学差异(d:p=0.415)。组间分析显示转染Trpv5-150-luci的Raw264.7细胞的荧光素酶活性与转染Trpv5-2k-lucie,Trpv5-1k-lucif以及Trpv5-500-lucig的Raw264.7细胞的荧光素酶活性相比,出现了较明显的降低,差异具有统计学意义(e:p=0.08,f:p=0.037,g:p=0.022)。转染Trpv5-2k-lucih,Trpv5-1k-lucii以及Trpv5-500-lucij的Raw264.7细胞,三组之间双荧光素酶活性的表达无明显统计学差异(h,i:p=0.641;h,j:p=0.438;i,j:p=0.749)。结果表明,TRPV5基因启动子在500bp至2000bp范围内都具备完整的启动子活性,但当启动子片段截短到150bp时,荧光素酶活性出现了明显的降低。说明TRPV5基因启动子500bp长度可能是其具备转录活性的必备区段。2.(1)统计学分析显示:与对照组相比,沉默转录结合因子AP-1,SP1以及NF-κB后,检测到共转染后的RAW264.7细胞荧光素酶活性均出现了明显的下降,差异具有统计学意义(沉默AP-1,p=0.008;沉默SP1,p=0.006;沉默NF-κB,p=0.001)。组间分析显示沉默NF-κB双荧光素酶活性下降最为明显。结果表明转录结合因子AP-1,SP1,NF-κB均参与了E2刺激下破骨细胞TRPV5的表达调控,其中NF-κB在E2调控破骨细胞TRPV5的表达中可能占最主要的作用。(2)对实验各组中RAW264.7细胞TRPV5基因的转录情况分析显示:1.正常阳性对照组(E2)TRPV5 m RNA表达明显,与Mock组相比,具有统计学意义(p=0.000)。说明E2能够有效刺激破骨细胞TRPV5的转录。2.实验组E2+si AP-1*,E2+si SP-1**和E2+si NF-κB***与阳性对照组(E2)相比,三组实验中TRPV5 m RNA表达明显下降,下降程度具有统计学差异(*:p=0.001,**:p=0.000,***:p=0.000),说明沉默转录结合因子AP-1、SP1和NF-κB后,在E2刺激下破骨细胞TRPV5的转录明显被抑制,表明转录结合因子AP-1、SP1和NF-κB在E2刺激破骨细胞TRPV5基因的表达过程中均起作用。3.实验组E2+si AP-1#,E2+si SP-1##和E2+si NF-κB###与Mock组相比,TRPV5 m RNA相对较明显,差异有统计学意义(#:p=0.001,##:p=0.000,###:p=0.000),说明在特异性沉默其中某一个转录结合因子后,另外两个转录结合因子仍起作用,进一步说明AP-1、SP1和NF-κB在E2刺激破骨细胞TRPV5基因的转录活动中均起作用。(3)Western-blot检测显示:1.E2实验组中TRPV5蛋白的电泳条带均匀单一,与Mock比较显得较宽较长,说明E2能够有效的刺激破骨细胞TRPV5蛋白的表达。2.在E2+si NF-κB实验组中,沉默转录结合因子NF-κB后,蛋白电泳条带清晰,分布均匀,与Mock组相比条带较宽长,但和E2+si NC及E2组比条带则较窄短。说明TRPV5的蛋白表达在E2+si NF-κB实验组中较Mock组多,但比E2+si NC和E2组少。表明转录结合参与NF-κB被特异性的沉默后,TRPV5基因的蛋白表达量出现了下降,但仍存在其他如AP-1,SP1等转录结合位点参与介导E2调控破骨细胞TRPV5基因的蛋白表达。(4)Ch IP检测实验显示:E2+si NF-κB组与Mock组相比较,其条带更宽,视野更透亮,但和E2+si NC组及E2组相比电泳条带却较窄,视野也较暗。说明E2+si NF-κB组TRPV5基因的免疫沉淀表达量,较Mock组多,但比E2+si NC和E2组少。结果说明沉默转录结合因子NF-κB后,能够与TRPV5基因有效结合的位点明显减少,导致TRPV5基因的免疫沉淀表达量明显降低,但仍存在其他转录结合位点如AP-1,SP1等能参与介导E2调控破骨细胞TRPV5基因的表达。结论:1.TRPV5基因启动子在500bp至2000bp范围内具备完整的启动子活性,其中基因启动子500bp范围内可能具备基因转录表达所需要的大部分转录结合位点。2.AP-1、SP1和NF-κB在雌激素调控TRPV5的转录激活中均起作用,其中NF-κB可能起主要作用。
【关键词】：TRPV5 雌激素 破骨细胞 AP-1 SP1 NF-κB
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R580
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-10
• 缩略词表10-11
• 前言11-14
• 第一部分 雌激素激活破骨细胞TRPV5基因启动子转录活性区域的确定14-26
• 一、实验材料14-18
• 二、实验方法18-24
• 三、实验结果24-25
• 四、讨论25-26
• 第二部分 AP-1、SP1和NF-κB介导E2调控破骨细胞TRPV5的表达26-48
• 一、实验材料27-29
• 二、实验方法29-41
• 三、实验结果41-45
• 四、讨论45-48
• 结论48-49
• 参考文献49-51
• 综述 TRPV5介导雌激素抑制破骨细胞骨吸收作用的研究进展51-57
• 参考文献54-57
• 硕士在读期间发表论文和参加科研工作情况57-58
• 致谢58

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本文编号：860117