Tim-3在糖尿病肾病中的表达

发布时间：2017-09-17 22:26

  本文关键词：Tim-3在糖尿病肾病中的表达

  更多相关文章： T细胞免疫球蛋白黏蛋白样分子-3 糖尿病肾病 巨噬细胞

【摘要】：[研究背景及目的]糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的常见重要并发症。根据国际糖尿病联盟(IDF)2015年的最新数据显示,全球糖尿病患病率为8.8%,中国患病人数居全球首位。30%-40%的糖尿病患者患有肾病。尽管近年来糖尿病肾病的诊断和治疗研究取得很大进展,但是DN的致残率和死亡率依然居高不下,因而深入研究DN的发生机制,寻求治疗DN的新靶点显得尤为重要。DN患者存在着长期的免疫系统激活和微炎症状态。多种炎症因子和免疫细胞参与DN的免疫损伤,炎症因子TNF-α、N IL-1、IL-6和IL-18在糖尿病肾病动物模型中明显升高,升高的TNF-α、IL-6 和 IL-18与肾脏指数及尿蛋白排泄率增加明显相关,并且增加血管内皮细胞的通透性、介导肾小球肥大、基底膜的增厚,引起内皮细胞的凋亡。越来越多的研究发现即使DN早期,在肾小球和肾间质就有多种免疫细胞(巨噬细胞、T细胞和B细胞等)的浸润,其中最主要的是巨噬细胞。巨噬细胞在肾脏的聚集会导致肾功能的下降,同时巨噬细胞分泌的炎性产物能诱导和加重炎症的发生。巨噬细胞具有极强的异质性,在不同环境刺激下分化为不同表型,发挥不同功能。众所周知,巨噬细胞主要有两种类型：经典活化型巨噬细胞(M1)和替代活化型巨噬细胞(M2)。M1主要分泌IL-12及iNOS等促炎因子,在Thl型免疫应答中发挥重要作用。M2高表达IL-10、CD206、IL-6及Arg-1等分子,表现为抗炎活性,可减轻STZ诱导的糖尿病小鼠中的巨噬细胞的浸润。在一定条件下,M1和M2亚型可相互转换。因此如果能找到促进巨噬细胞向M2转化的分子,就有可能找到对DN进行免疫基础治疗的新的作用靶点。Tim-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containingmolecule-3)是2002年发现的新型免疫调节分子,最初被认为特异性表达于活化的Thl细胞上,随后的研究发现Tim-3广泛表达于多种固有免疫细胞,如NK、DC、巨噬细胞等。研究证实,Tim-3负向调控Th1细胞功能,并诱导Thl细胞凋亡介导免疫耐受的形成,参与多种自身免疫疾病发生。以上研究充分显示了Tim-3在免疫负调控和免疫耐受诱导中的重要作用及其在免疫性疾病治疗中的潜在价值。2015年Gut报道,肝细胞肝癌肿瘤微环境中TGF-β在转录水平促进巨噬细胞Tim-3表达,并且促进巨噬细胞的M2极化,激活NF-kB通路促进巨噬细胞分泌IL-6,从而促进肝癌细胞的生长,提示Tim-3在组织微环境中调控巨噬细胞参与疾病发生。有报道,在1型糖尿病中,应用Tim-3阻断性抗体(RMT23)阻断Gal-9-Tim3途径可以抑制DC的活化,从而抑制Thl免疫反应,提示Tim-3可能参与糖尿病的发病。那么,Tim-3在糖尿病肾病中的表达及作用机制如何,迄今尚未见报道。本研究以DN患者和动物模型为研究对象,探讨Tim-3在DN中的表达。[方法与结果]1.DN患者肾组织Tim-3表达明显升高免疫组化检测DN患者肾组织中Tim-3的表达,结果显示DN组Tim-3表达明显升高；免疫组化双染检测糖尿病肾病肾穿组织中CD68及Tim-3的表达,结果显示CD68与Tim3显著共定位,且DN肾组织中Tim-3+CD68+细胞数显著高于HD组。2.DN患者外周血单核细胞上Tim-3较健康人明显升高从山东大学齐鲁医院收集18例DN患者和16例健康人新鲜外周血,提取单个核细胞,检测CD14+单核细胞上Tim-3的表达。结果显示：DN患者外周血 CD14+单核细胞Tim-3表达较健康人明显升高(P＜0.05),且M1型单核细胞上Tim-3的表达显著升高(P0.05),提示单核细胞Tim-3可能通过调控单核巨噬细胞参与DN免疫损伤。3.DN小鼠肾脏和腹腔巨噬细胞Tim-3表达升高在摘除小鼠一侧肾脏的前提下,应用链脲佐菌素STZ(50mg/kg,溶于PH=4.45柠檬酸缓冲液)腹腔注射,连续5天,成功建立小鼠模型,检测小鼠血肌酐、尿白蛋白肌酐比值、肾组织病理改变(PAS染色)。并用Type I胶原蛋白酶提取小鼠肾脏单个核细胞,流式检测F4/80+CD11b+巨噬细胞Tim-3的表达。结果显示：模型鼠血糖、尿白蛋白肌酐比值明显升高,肾组织PAS染色可见模型鼠肾小球系膜基质明显增多；肾脏F4/80+CD11 b+巨噬细胞上Tim-3的表达明显升高；(P0.05)。腹腔巨噬细胞上Tim-3的表达明显上调(P0.05)。我们应用WesternBlot方法检测肾脏Tim-3的表达,同样发现DN小鼠肾组织Tim-3表达明显上调(P0.05),进一步提示Tim-3可能通过调控单核巨噬细胞参与DN免疫损伤。4.DN小鼠Treg细胞比例下降,Th17细胞比例升高应用流式细胞术分析DN小鼠脾脏单个核细胞中Treg和Th17细胞的比例Treg比例有下降趋势,Th17细胞比例明显升高(P0.05)；同时应用CBA技术检测小鼠血清多种炎症因子的分泌,发现IL-6有升高趋势。5.DN小鼠肾组织IL-1β、TNF-α和IL-6表达明显升高用Trizol法提取肾组织RNA,采用RT-PCR技术检测小鼠肾脏IL-1β、TNF-α、IL-6的表达,结果显示,与正常对照组相比,DN组小鼠这3种促炎因子的表达均明显升高。6.Tim-3阻断可以条调控巨噬细胞的功能无菌分离DN小鼠腹腔巨噬细胞,提前用Anti-Tim3抗体预处理后,收集巨噬细胞,流式检测TNF-α的表达,结果显示,Tim-3阻断后,巨噬细胞TNF-α的表达明显升高。[结论]糖尿病肾病患者及动物模型单核/巨噬细胞中Tim-3表达明显升高,且呈M1表型。提示Tim-3可能通过调控巨噬细胞极化参与糖尿病肾病的发生发展。
【关键词】：T细胞免疫球蛋白黏蛋白样分子-3 糖尿病肾病 巨噬细胞
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符号说明13-14
• 前言14-17
• 材料和方法17-33
• 结果33-35
• 讨论35-37
• 结论37-38
• 附表38-39
• 附图39-46
• 参考文献46-51
• 综述51-59
• 参考文献55-59
• 致谢59-60
• 攻读学位期间发表的学术论文60-61
• 附件61

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本文编号：871722