MiR-106b在类风湿关节炎骨关节破坏中的作用及机制研究

发布时间：2017-09-18 13:34

  本文关键词：MiR-106b在类风湿关节炎骨关节破坏中的作用及机制研究

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【摘要】：类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种累及关节的慢性炎症性自身免疫性疾病,主要表现为炎性细胞浸润、滑膜增生、关节软骨及骨质破坏。RA的发生机制尚不明确,目前多数学者认为T细胞介导的免疫调节的异常在RA的发生发展中起关键作用。Mi R-106b是新近发现的一种mi RNA,既往研究证实其在肺癌、胃癌、肝癌和肾癌等组织中高表达,主要作为一种癌基因发挥作用;近年来mi R-106b在炎症、骨改建以及免疫调节中的作用也逐渐引起重视。本研究在成功制备牛Ⅱ型胶原诱导的小鼠关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型基础上,研究调控mi R-106b对小鼠CIA的治疗作用,并对其作用机制进行初步探讨。目的:探讨靶向干预mi R-106b对RA骨关节破坏的治疗作用,并进一步明确mi R-106b调控RA发生的机理。方法:雄性DBA/1小鼠40只,采用随机数字表法分成4组:对照组(Sham组),慢病毒载体组(NC组),mi R-106b mimic组(Mimic组)和mi R-106b inhibitor组(Inhibitor组),每组10只小鼠。NC组,Mimic组和Inhibitor组在第二次免疫前1天(D20)分别经眼眶注射空慢病毒载体、mi R-106b mimic和mi R-106b inhibitor,剂量为200μl(1×108U/ml);Sham组注射200μl生理盐水。观察小鼠的体重、足掌厚度,并对关节炎的肿胀程度进行评分(每三天1次)。D56处死小鼠,Micro-CT检查评估骨组织破坏程度,HE染色评估滑膜增生和炎性细胞浸润程度,番红O染色检测软骨破坏程度,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测成熟破骨细胞,免疫组织化学染色检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)以及核因子-κB受体活化因子配体(receptor activators of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)的表达变化;RT-PCR检测CIA小鼠膝关节中mi R-106b的表达变化;ELISA法检测外周血中抗Ⅱ型胶原(collagenⅡ,CⅡ)抗体,TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、RANKL和OPG水平;流式细胞术检测脾脏中巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞以及T细胞亚群变化。结果:NC和Mimic组小鼠D21开始,体重明显下降,与Sham组比较,差异有统计学意义;Inhibitor组在D35时升高小鼠体重,在D42时,小鼠体重明显恢复,与NC组比较,差异有统计学意义(p0.05)。D21开始CIA小鼠足爪出现较明显的红肿并逐渐加重,Inhibitor组小鼠足爪红肿逐渐减轻,D49足掌厚度为(2.58±0.09)mm、关节炎评分为(10.2±0.98)与NC组[(3.06±0.07)mm,(13.8±1.65)比较,差异有统计学意义(p0.05)。Micro-CT扫描结果显示NC和Mimic组有明显的骨质破坏,抑制mi R-106b后骨质破坏明显减轻;Inhibitor组骨体积(BV)、骨体积分数(BV/TV)、骨面积分数(BS/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)分别为6.85±0.24 mm3、22.52±0.62%、9.46±2.02mm-1、0.31±0.06 mm,与NC组(5.61±0.35 mm3、16.26±1.42%、13.32±1.85 mm-1、0.24±0.06 mm)比较,差异有统计学意义(p0.05)。HE染色结果显示CIA小鼠关节腔可见大量炎症细胞浸润,滑膜增生明显;靶向阻断mi R-106b后滑膜组织炎症明显减轻。番红O染色结果提示NC组和Mimic组软骨细胞大量坏死,局部软骨层几乎完全消失,Inhibitor组软骨细胞增多,软骨层结构较完整,软骨破坏评分(0.92±0.37)明显优于NC组(2.5±0.51),差异有统计学意义(p0.05)。TRAP染色结果显示CIA小鼠关节破坏局部有大片紫红色深染区域,Inhibitor组仅可见少量阳性染色区域,提示mi R-106b inhibitor能够抑制破骨细胞活化。定量RT-PCR结果显示mi R-106b在CIA小鼠膝关节中高表达,mi R-106b inhibitor能明显降低mi R-106b在小鼠膝关节中的表达,与NC组比较,差异有统计学意义(p0.05)。免疫组织化学染色结果显示抑制mi R-106b能减少TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2和RANKL的表达,增加OPG的表达。血清中细胞因子检测结果显示,与Sham组比较,CIA小鼠血清中抗CⅡ抗体水平明显升高,mi R-106b inhibitor治疗后,抗CⅡ抗体含量降为(89.51±19.32ng/L),与NC组(118.53±11.32 ng/L)比较,差异有统计学意义(p0.05)。CIA小鼠外周血中TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2的含量明显增加,mi R-106b inhibitor能抑制上述因子的表达。ELISA结果显示,mi R-106b inhibitor能促进OPG的分泌,抑制RANKL的表达,使RANKL/OPG比值明显降低,与NC组比较差异有统计学意义(p0.05)。流式细胞术结果显示CIA小鼠脾脏中CD11b~+巨噬细胞、CD11c~+树突状细胞和GR1~+中性粒细胞比例显著增高;同时CD4~+、CD28~+、CD154~+T细胞比例也明显增高,而CD8~+T细胞比例减少,CD4~+/CD8~+比值上升。mi R-106b inhibitor治疗组能显著降低脾脏中CD11b~+、CD11c~+、CD11c~+以及CD4~+、CD28~+、CD154~+T细胞比例,同时升高CD8~+T细胞比例,恢复CD4~+/CD8~+比值。结论:本实验研究显示抑制mi R-106b的表达可以减轻CIA小鼠关节炎症和骨质破坏;抑制mi R-106b能减少CIA小鼠脾脏中巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞的分布;抑制mi R-106b能调节CIA小鼠脾脏中T细胞亚群的分布,恢复CD4~+/CD8~+比值。
【关键词】：类风湿关节炎 炎症 骨质破坏 mi R-106b T淋巴细胞
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R593.22
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 前言12-15
• 材料和方法15-31
• 结果31-44
• 讨论44-48
• 结论48-49
• 参考文献49-56
• 综述56-79
• 参考文献68-79
• 中英文缩略词表79-80
• 攻读学位期间公开发表的论文80-81
• 本研究得到以下基金资助81-82
• 致谢82-83

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本文编号：875841