RIG-I抑制胰岛β细胞增殖机制研究

发布时间：2017-09-19 03:27

  本文关键词：RIG-I抑制胰岛β细胞增殖机制研究

  更多相关文章： 胰岛β细胞 RIG-I Src 细胞周期 分子机制

【摘要】：目的：R1G-Ⅰ (retinoic acid inducible gene-I)是一个典型的胞内模式识别受体,能识别胞内病毒双链RNA,激活并参与多种炎症因子表达的调节。最近有研究表明：1型糖尿病中,RIG-Ⅰ能激活,且参与胰岛p细胞功能下调及糖尿病的发生。而RIG-Ⅰ是否参与2型糖尿病的发生发展并不清楚。本研究旨在探讨RIG-Ⅰ对胰岛p细胞增殖的调控机制极其对β细胞功能失代偿的影响。方法：采用糖脂毒性(0.4 mM棕榈酸+16.7 mM葡萄糖)、炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-α)及脂多糖(LPS)刺激胰岛Min6细胞,并提取糖尿病db/db小鼠的胰岛,建立胰岛β细胞体外和体内2型糖尿病模型。免疫印迹(Western blot)技术分别检测激活的原癌基因Src (sarcoma gene)及RIG-Ⅰ的蛋白水平变化；免疫荧光观察磷酸化Src (Y416)及RIG-Ⅰ的含量变化；EdU荧光标记、流式细胞术分别评价细胞增殖及细胞周期进程的变化。给予RIG-Ⅰ特异性激活剂维甲酸(retinoic acid, RA)激活RIG-Ⅰ, Real-time RT-PCR和Western blot测定RIG-Ⅰ的]mRNA水平及蛋白水平；噻唑蓝(MTT)法检测胰岛p细胞的生长活力,EdU荧光标记分析胰岛p细胞增殖情况,并用流式细胞术评价胰岛β细胞的周期进程变化。采用胰岛素样生长因子-Ⅰ (Insulin like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)和维甲酸联合处理Min6细胞,实时定量RT-PCR和免疫印迹分别检测Src基因下游信号分子Skp2、STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3, STAT3)及细胞周期蛋白cyclin D1、E、CDK2、P27和p21的mRNA和蛋白水平；免疫荧光观察磷酸化STAT3亚细胞定位；荧光素酶报告基因实验(Luciferase Assay)分析STAT3的转录活性；免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)检测p-Src分别与RIG-Ⅰ、STAT3的蛋白结合变化。结果：糖脂毒性(glucolipotoxicity)、炎症因子(TNF-α)及脂多糖(LPS)能显著上调胰岛β细胞磷酸化Src及RIG-Ⅰ的蛋白水平；上调的RIG-Ⅰ导致胰岛p细胞的增殖能力和生长活力都明显下降,细胞凋亡增加,且细胞周期阻滞于G1期；胰岛素样生长因子-I处理Min6细胞后,RIG-Ⅰ的激活对cyclin D1、E、 CDK2、P27和p21的mRNA水平均无显著影响,但诱导P27蛋白含量显著上调；RIG-Ⅰ激活也抑制了Src基因下游信号分子Skp2的表达、减弱了磷酸化STAT3的转录活性且阻碍了Src与STAT3的蛋白相互结合。结论：糖脂毒性、炎症因子(TNF-α)及脂多糖(LPS)能显著激活胰岛p细胞的Src活性。RIG-Ⅰ的上调能竞争性结合激活Src,从而阻碍p-Src与STAT3的蛋白结合,下调Skp2的蛋白水平和上调周期蛋白P27的表达,最终诱导胰岛β细胞G1期阻滞,抑制其增殖。本论文研究揭示了RIG-Ⅰ的激活能够阻断Src/STAT3通路,通过影响Skp2/P27信号诱导细胞周期阻滞于G1期,使β细胞增殖受到抑制,最终在机体中导致胰岛β细胞的整体功能失代偿。这可能是2型糖尿病发生发展的重要诱因,该研究能为2型糖尿病的防治探寻新的药物靶点和途径。
【关键词】：胰岛β细胞 RIG-I Src 细胞周期 分子机制
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1
【目录】：

• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 前言10-14
• 材料和方法14-31
• 1. 实验试剂与材料14-17
• 1.1 实验动物14
• 1.2 细胞系14
• 1.3 质粒14
• 1.4 仪器设备14-15
• 1.5 实验试剂15-17
• 2. 研究方法17-31
• 2.1 细胞培养17
• 2.2 维甲酸(retinoic acid)及其他相关药物配制17
• 2.3 总RNA的提取17-18
• 2.4 Real-time RT-PCR18-20
• 2.5 蛋白质提取及其浓度测定20-21
• 2.6 小鼠原代胰岛细胞的分离和培养21-23
• 2.7 免疫印迹(Western Blot)23-25
• 2.8 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)25-26
• 2.9 MTT法26-27
• 2.10 免疫荧光检测27
• 2.11 EdU荧光标记细胞增殖实验27-28
• 2.12 细胞转染28-29
• 2.13 流式细胞术检测29
• 2.14 荧光素酶报告基因实验(Luciferase Assay)29-30
• 2.15 数据处理30-31
• 结果31-38
• 1. 2型糖尿病模型中酪氨酸激酶Src被激活31
• 2. 小鼠2型糖尿病模型中β细胞增殖受到抑制31-32
• 3. RIG-I在2型糖尿病模型中功能增强32
• 4. RIG-I上调抑制胰岛β细胞增殖32-33
• 5. RIG-I激活导致胰岛β细胞周期相关蛋白P27积累33-34
• 6. RIG-I诱导Skp2依赖P27蛋白水平增加34-35
• 7. STAT3上调胰岛β细胞Skp2的表达35
• 8. RIG-I功能上调抑制STAT3的转录活性35-36
• 9. RIG-I能阻断Src与STAT3的结合36-38
• 实验数据及英文注释38-61
• 讨论61-64
• 小结64-65
• 参考文献65-71
• 附录(一) 综述71-88
• 参考文献81-88
• 附录(二) 缩略词表88-89
• 附录(三) 发表文章89-90
• 附录(四) 致谢90

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 ;“瑞金国际内分泌论坛-胰岛β细胞研究”会讯及征文通知(第二轮)[J];中华内分泌代谢杂志;2006年04期

2 合湫;苏恒;;胰岛β细胞损伤的分子机制探讨[J];实用糖尿病杂志;2011年06期

3 杨淑秋;;胰岛β细胞瘤[J];广西医学;1987年01期

4 韩凤兰;胰岛β细胞瘤(附13例临床分析)[J];广东医学;1988年04期

5 童名瑞,田新良;睁眼昏迷1月的胰岛β细胞癌1例报告[J];新医学;1988年09期

6 邱子谦;杨传之;刘广和;;误诊为癔病的胰岛β细胞瘤2例[J];临床误诊误治;1988年03期

7 张瑞军;胰岛β细胞瘤1例[J];山东医药;1997年08期

8 蒋旭超;谢志芳;章卫平;;胰岛β细胞发育与再生的研究进展[J];中国病理生理杂志;2013年10期

9 逄曙光,孙金凤;胰岛β细胞瘤5例误诊原因分析[J];山东医药;2000年11期

10 郝淑梅,蒋丹峰;长期误诊的胰岛β细胞瘤1例报告[J];中国综合临床;2000年04期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 费玉娥;金雪光;;屡次误诊为竭症的胰岛β细胞瘤一例[A];2006年浙江省精神病学学术会议论文汇编[C];2006年

2 刘静;田利民;郭茜;王锐;樊瀛哲;余烨;;大鼠内吗啡肽对胰岛β细胞损伤的保护作用[A];2006年中华医学会糖尿病分会第十次全国糖尿病学术会议论文集[C];2006年

3 林建立;侯建明;高政南;陈刚;黄慧彬;温俊平;梁继兴;;应用细胞片层技术研究胰岛β细胞的细胞保护[A];中华医学会第十一次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2012年

4 龙健;苏艳新;邓华聪;;脂联素抗胰岛β细胞脂性凋亡及其机制[A];中华医学会第十一次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2012年

5 李珊珊;孔德明;李雪梅;;使用遗传学可示踪转基因斑马鱼技术进行甲硝唑诱导胰岛β细胞破坏和再生的初步研究[A];2010年贵州省中西医结合学会内分泌学术会议论文集[C];2010年

6 鹿国晖;曾凡星;方子龙;;注射重组人生长激素对运动大鼠胰岛β细胞形态和功能的影响[A];2002年第9届全国运动医学学术会议论文摘要汇编[C];2002年

7 张宏利;骆天红;冯龄;赵臾;李文毅;徐佳;李杲;罗敏;;多发性内分泌肿瘤1型基因对胰岛β细胞发育和分化作用的研究[A];2006年中华医学会糖尿病分会第十次全国糖尿病学术会议论文集[C];2006年

8 周琳;薛耀明;沈洁;高方;;胰淀素对体外培养胰岛β细胞胰岛素分泌影响的分子机制[A];中华医学会第六次全国内分泌学术会议论文汇编[C];2001年

9 李淼;何清华;国汉邦;黄秀清;满永;路永刚;周迎生;王抒;黎健;;低密度脂蛋白与极低密度脂蛋白引起胰岛β细胞氧化损伤作用的机制探讨[A];第四届全国血脂分析与临床学术研讨会暨第九届全国脂蛋白学术会议论文汇编[C];2008年

10 赵玉峰;裴建明;朱运龙;陈晨;;亚油酸通过双信号途径激活大鼠胰岛β细胞上ATP敏感性钾通道[A];2008年神经内分泌暨神经免疫内分泌学术研讨会论文摘要汇编[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 记者 白毅;调控胰岛β细胞代偿性增殖新机制被发现[N];中国医药报;2014年

2 吴一福;僵知饮对胰岛β细胞损伤有修复作用[N];中国医药报;2005年

3 冯卫东;外分泌细胞直接转化胰岛β细胞获得成功[N];科技日报;2008年

4 解放军总医院内分泌科主任医师 潘长玉;降糖同时勿忽略胰岛β细胞[N];健康报;2010年

5 中山大学附属第二医院内分泌科主任医师 程桦 教授;儿童糖尿病患病率明显增加[N];健康时报;2008年

6 ;一线降糖药物存在严重先天不足[N];卫生与生活报;2007年

7 本报记者　赵绍华;关于“干细胞移植治愈糖尿病”[N];健康时报;2003年

8 郑倩怡;肠促胰素研究带来降糖新理念[N];中国医药报;2010年

9 陈金伟;药名差以毫厘 药效失之千里[N];保健时报;2007年

10 吴纪;营造生命的春天[N];大众科技报;2000年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 王洪东;长期雄激素暴露对大鼠胰岛β细胞GSIS功能的影响及机制研究[D];南京医科大学;2015年

2 米宝明;两种胰岛β细胞PET显像探针的制备与实验研究[D];苏州大学;2016年

3 孙力;孤儿核受体NR2E1在2型糖尿病发病机制中的研究[D];武汉大学;2015年

4 尤卫绝;miR-24在糖尿病胰岛β细胞损伤中的作用和机制研究[D];南京医科大学;2016年

5 陈志红;携有鼠胰岛素样生长因子1重组腺病毒对胰岛β细胞的保护性研究[D];山东大学;2009年

6 凌家俭;一氧化氮在胰岛β细胞内对环加氧酶2表达、前列腺素E2合成的影响及前列腺素E2引起胰岛β细胞功能紊乱作用机制的研究[D];南京医科大学;2005年

7 李敏;高迁移率族蛋白1在1型糖尿病鼠胰岛β细胞损伤中的作用机制[D];复旦大学;2012年

8 龙健;脂联素抑制胰岛β细胞脂性凋亡及其机制研究[D];重庆医科大学;2012年

9 陈文斌;表观遗传调控对胰岛β细胞发育和功能以及糖尿病发病的影响和机制[D];山东大学;2013年

10 卢忠燕;FOXO1转录因子在胰岛β细胞中的作用及机制研究[D];第三军医大学;2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 唐冉琪;基于靶点PTP1B的胰岛β细胞保护的实验研究及抗代谢综合征药物筛选[D];北京协和医学院;2015年

2 苗天翼;苹果多酚基于GLP-1受体途径降糖作用的机制研究[D];河北医科大学;2015年

3 王玉琢;MicroRNA-126对大鼠胰岛β细胞胰岛素信号通路的调控作用及机制[D];宁夏医科大学;2015年

4 赵浩辰;基于两亲性聚合物的胰岛β细胞靶向成像体系的设计与合成[D];吉林大学;2016年

5 王明明;Irisin对胰岛β细胞增殖和凋亡的影响及机制研究[D];山西医科大学;2016年

6 陈健媚;FTZ含药血清改善氧化应激引起的INS-1胰岛β细胞损伤的作用及机制探究[D];广东药科大学;2016年

7 罗瑞琼;激光拉曼光谱系统下实时、非标记监测胰岛β细胞胞吐活动的研究[D];广西医科大学;2016年

8 李占军;miR-125b对胰岛β细胞增殖凋亡的影响及其作用机制[D];南京医科大学;2014年

9 况雪梅;5-Aza-CdR对胰岛β细胞株中miR-375甲基化及表达水平的研究[D];石河子大学;2016年

10 吴婧;2型糖尿病患者血浆血管内皮生长因子B水平及其与胰岛β细胞功能的关系探讨[D];重庆医科大学;2016年

，

本文编号：879216