培养、扩增及动员糖尿病鼠循环纤维细胞的实验研究

发布时间：2017-09-22 15:43

  本文关键词：培养、扩增及动员糖尿病鼠循环纤维细胞的实验研究

  更多相关文章： 糖尿病 循环纤维细胞 细胞培养 细胞活性 糖尿病 联合动员 循环纤维细胞 (cFb) AMD3100 G-CSF

【摘要】：第一部分正常小鼠和糖尿病小鼠循环纤维细胞体外培养的比较[目的]慢性创面的细胞治疗是当前创伤医学的研究热点之一。本实验通过采集c57小鼠和基因自发突变db/db糖尿病小鼠外周血单个核细胞,进行循环纤维细胞体外培养,观察其体外增殖活性,旨在为创面的细胞治疗提供可靠的细胞,为后续开展促进糖尿病创面愈合的动物实验研究提供依据打下基础。[方法]密度梯度离心法收集c57小鼠和db/db糖尿病小鼠外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)根据所查文献及前期实验,调整细胞密度,平铺接种于20%胎牛血清+1%的高糖DMEM+0.5%双抗链霉素、青霉素配制的培养液中,然后连续观察培养,每间隔2-3天给予更换细胞培养液,换液时除给予室温PBS漂洗之外,不做任何其它处理。分别对细胞接种后当天、第3、5、7、10天于倒置相差显微镜下观察细胞增殖克隆以及形态变化,并通过数码相机采集图片。细胞培养后对c57小鼠和db/db糖尿病小鼠循环纤维细胞同一时间点细胞形态、增殖活性进行观察,有无区别,并对其分离成功率、cfb获得率及增殖活性进行观察。[结果]在体外cFb分离培养过程中,先后约30份糖尿病小鼠肝素抗凝血标本和38份c57小鼠肝素抗凝血标本成功纳入本次实验。对其分离成功率、cFb获得率及增殖活性进行统计,结果显示：糖尿病小鼠分离PBMCs17份(57%),获得cFb10份(33%)；而c57分离PBMCs28份(73%),获得cFb18份(47%)。对培养后获得的贴壁梭形细胞样细胞进行体外增殖活性观察显示,c57小鼠cFb体外培养5-7天细胞融合率可达约60%,而糖尿病小鼠cFb的体外增殖活性则明显延迟,需在体外培养10至14天细胞融合率才能达到约50%,在相差显微镜下观察,两组间细胞形态未见明显差异。[结论]1、糖尿病小鼠外周血液来源的cFb在获得成功率、增殖活性等方面均低于c57小鼠；2、无论是正常小鼠还是糖尿病小鼠,虽然体外扩增可以获得成功,但总体结果还不稳定,尚不能获得理想数量的循环纤维细胞。[目的]在前期研究的基础上,发现糖尿病状态下外周血循环纤维细胞数目较少,体外培养困难,为增加探外周血cFb数量,以提高糖尿病外周血cFb体外培养、扩增成功率,本阶段实验通过动员自体骨髓循环纤维细胞,并对动员后不同时间点外周血中循环纤维细胞的数量进行观察比较,从而优选动员方法和采集细胞时机,旨在为cFb体外培养、扩增提供稳定、足量的细胞来源,为后续创面治疗研究打下基础,为临床开展慢性创面的细胞治疗提供新的方向和思路。[方法]采用10～11周龄自发突变糖尿病C57BL/KsJ (db/db)小鼠60只,随机分为A组(空白对照组)、B组(AMD3100+生理盐水组)、C组(AMD3100+G-CSF组)3组,每组各20只,AMD3100采取单日注射,G-CSF连续注射时间为5天,A组、B组、C组各设3d、5d、7d、10d四个时间点取材,到达各时间点后随机取5只小鼠,腹腔注射麻醉后心脏采血并进行流式细胞仪检测CDllb、α-SMA阳性细胞标记率,结果取均值以x+s表示,统计学处理数据并进行对比分析。[结果]A组在四个时间点双免疫荧光染色阳性细胞比例均无明显差异(p0.05)。B组与C组动员后双免疫荧光染色阳性细胞比例呈升高趋势,至第5天达到峰值,后又呈逐渐下降趋势,且B组、C组各时间点双阳性细胞比例均较A组增加(p0.05)；C组较B组双阳性细胞比例增加(p0.05)；[结论]AMD3100联合G-CSF和单一使用AMD3100对外周血cFb均有动员作用,且于动员后第5天cFb数量达到高峰；联合动员效果优于单一动员效果。
【关键词】：糖尿病 循环纤维细胞 细胞培养 细胞活性 糖尿病 联合动员 循环纤维细胞 (cFb) AMD3100 G-CSF
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R641
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-15
• 第一部分 正常小鼠和糖尿病小鼠循环纤维细胞体外培养的比较15-30
• 引言15-16
• 材料与方法16-20
• 实验结果20-24
• 讨论24-27
• 参考文献27-30
• 第二部分 AMD3100联合G-CSF动员糖尿病小鼠循环纤维细胞的研究30-50
• 引言30-32
• 材料与方法32-37
• 实验结果37-43
• 讨论43-47
• 参考文献47-50
• 结论50
• 存在不足及改进方法50-51
• 综述51-58
• 参考文献55-58
• 攻读学位期间获得的学术成果58-59
• 致谢59

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本文编号：901676