ERK5信号通路在雌激素抑制TNF-α诱导成骨细胞凋亡中的作用及机制的实验研究

发布时间：2017-09-22 16:36

  本文关键词：ERK5信号通路在雌激素抑制TNF-α诱导成骨细胞凋亡中的作用及机制的实验研究

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【摘要】：目的:雌激素缺乏与骨量丢失密切相关,且能影响骨组织的力学响应能力。雌激素骨保护作用的具体机制尚不十分明确,对这一机制的研究有助于揭示绝经后骨质疏松的发病机制,并为其治疗提供新思路、新靶点。本课题以ERK5分子为核心,研究雌激素抑制成骨细胞凋亡的相关机制,结果将为骨量减少性疾病治疗药物的开发提供理论依据。方法:(一)体内实验:随机将15只6周龄(性成熟)的雌性昆明小鼠分为5组,每组3只,随机选取4组行双侧卵巢切除手术,另外一组行假手术并作为对照。术后3天开始给予不同药物干预,对照组平行喂养,切除卵巢的4组中,一组平行喂养,一组每日按50mg/kg体重的剂量腹腔注射ERK5特异性阻断剂XMD8-92一次,一组每日按5mg/kg体重的剂量皮下注射17β-雌二醇一次,一组每日分别按50mg/kg、5mg/kg体重的剂量腹腔注射XMD8-92并皮下注射17β-雌二醇各一次,每周行双能X线骨密度检查监测股骨骨密度的变化情况,当单纯摘除卵巢组骨密度下降至与初始值相比较差异有统计学意义时终止实验,麻醉下颈椎脱臼法处死小鼠收集股骨标本,每组样本经固定后对股骨远端干骺端部位分别行Micro-CT扫描和组织学检查。(二)体外实验:首先对体外培养的小鼠源性MC3T3-E1成骨细胞分别孵育不同时间和不同浓度的17β-雌二醇,通过Western-Blot研究雌激素活化ERK5的规律,明确最佳激活浓度及时间。再通过流式细胞术、Hoechst33258染色及TUNEL/DAPI复染研究不同干预条件下成骨细胞的凋亡情况,明确ERK5在成骨细胞凋亡调节中的作用。最后通过Western-Blot及酶标仪检测不同干预条件下成骨细胞凋亡蛋白表达量的差异,明确ERK5在成骨细胞凋亡调节中的具体作用机制。结果:(一)体内实验:骨密度监测结果显示,在最初的一段时间内,各组骨密度变化均不明显,各组间也没有明显差异。随着时间的推移和用药的继续,各组小鼠骨密度开始出现较明显的变化趋势,组间差异也逐渐变得明确。8周后终止实验,单纯摘除卵巢组小鼠骨密度较初始值及对照组分别降低38.07%和37.06%;而切除卵巢后腹腔注射ERK5特异性阻断剂XMD8-92组小鼠骨密度较对照组降低47.89%,更较单纯摘除卵巢组小鼠骨密度低17.21%;切除卵巢后外源性补充雌激素组小鼠骨密度较单纯摘除卵巢组小鼠骨密度增高151.78%,甚至比对照组小鼠骨密度增加55.92%;摘除卵巢后先注射XMD8-92阻断ERK5活化再外源性补充雌激素组小鼠骨密度较单纯外源性补充雌激素组降低32.45%。Micro-CT扫描及三维重建结果显示,同对照组相比,切除卵巢后小鼠骨小梁体积、数目及厚度分别减少30.45%、42.30%和17.81%,小梁间隙增宽35.89%;卵巢切除后与ERK5特异性阻断剂XMD8-92联合干预下小鼠骨小梁数目更少,体积及厚度也更小,小梁间隙更宽;卵巢切除后给予外源性补充17β-雌二醇组骨小梁体积、数目及厚度分别较单纯摘除卵巢组增加310.50%、196.91%和323.39%,小梁间隙减少81.95%;而在卵巢切除同时给予XMD8-92和雌激素干预组小鼠骨小梁体积、数目及厚度较单独给予雌激素干预时分别减少62.42%、38.71%和65.55%,小梁间隙增加185.20%。HE染色结果与骨密度监测及Micro-CT扫描结果一致。(二)体外实验:对小鼠源性MC3T3-E1成骨细胞孵育10(-6)mol/L的17β-雌二醇,随孵育时间延长,ERK5活化水平增加,在15min时达到高峰(77.80±7.70%),之后迅速降低;用不同浓度的17β-雌二醇(10(-9)-10(-5)mol/L)分别孵育成骨细胞15min,发现ERK5活化水平随17β-雌二醇浓度的增加而增加,在10(-6)mol/L已达高峰(52.16±8.87%);5umol/L的XMD8-92孵育1h能有效阻断ERK5的磷酸化。流式细胞术计数结果显示,40ng/ml的TNF-α能有效诱导MC3T3-E1成骨细胞发生凋亡(49.10±5.29%),10(-6)mol/L的17β-雌二醇孵育15min有效刺激ERK5活化并显著降低TNF-α诱导的凋亡率(14.51±3.04%),XMD8-92阻断雌激素对ERK5的活化后TNF-α诱导的凋亡率升至48.29±6.33%。Hoechst33258染色及TUNEL/DAPI复染结果类似。进一步的Western-Blot及酶标仪检测结果显示,TNF-α作用下成骨细胞Bax表达增加,Bcl-2表达减少,Bax/Bcl-2比例增加,Caspase3活性增加;17β-雌二醇预处理刺激ERK5活化后Bax表达减少,Bcl-2表达增加,Bax/Bcl-2比例减小,Caspase3活性降低;XMD8-92阻断雌激素对ERK5的活化后Bax表达增加,Bcl-2表达减少,Bax/Bcl-2比例增加,Caspase3活性增加。结论:1.ERK5信号通路参与雌激素的骨保护作用,与绝经后骨质疏松的发生发展有关;2.雌激素以时间、浓度依赖的方式激活成骨细胞内ERK5后,通过上调Bcl-2表达,下调Bax表达,增加Bcl-2/Bax比例,进而抑制Caspase级联反应,抑制TNF-α诱导的成骨细胞凋亡。
【关键词】：细胞外信号调节激酶5(ERK5) 雌激素 肿瘤坏死因子α(TNF-α) 成骨细胞 凋亡
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R580
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一部分 ERK5信号通路在绝经后骨质疏松发生发展中作用的研究10-19
• 1.1 前言10-11
• 1.2 材料与方法11-13
• 1.2.1 实验材料11-12
• 1.2.2 实验方法12-13
• 1.3 实验结果13-18
• 1.3.1 XMD8-92加剧绝经后骨量减少并影响雌激素的骨保护作用过程13-15
• 1.3.2 OVX/XMD8-92/E2处理后股骨样本Micro-CT扫描及三维重建结果15-17
• 1.3.3 OVX/XMD8-92/E2处理后股骨样本HE染色结果17-18
• 1.4 小结18-19
• 第二部分 ERK5信号通路在雌激素抑制TNF-α 诱导成骨细胞凋亡中作用的研究19-34
• 2.1 前言19-20
• 2.2 材料与方法20-27
• 2.2.1 实验材料20-22
• 2.2.2 实验方法22-27
• 2.3 实验结果27-32
• 2.3.1 17β -雌二醇对成骨细胞内ERK5的活化作用27-28
• 2.3.2 XMD8-92对 17β - 雌二醇激活成骨细胞内ERK5的阻断作用28
• 2.3.3 成骨细胞凋亡检测28-32
• 2.4 小结32-34
• 第三部分 ERK5信号通路在雌激素抑制TNF-α 诱导成骨细胞凋亡中作用机制的研究34-45
• 3.1 前言34-35
• 3.2 材料与方法35-39
• 3.2.1 实验材料35-37
• 3.2.2 实验方法37-39
• 3.3 实验结果39-43
• 3.3.1 XMD8-92上调成骨细胞中Bax/Bcl-2 比例39-40
• 3.3.2 XMD8-92促进TNF-α 诱导的成骨细胞中Bax/Bcl-2 比例上调40
• 3.3.3 XMD8-92抑制 17β -雌二醇诱导的成骨细胞中Bax/Bcl-2 比例下调40-41
• 3.3.4 在TNF-α 作用下XMD8-92抑制 17β -雌二醇诱导的成骨细胞中Bax/Bcl-2 比例下调41-42
• 3.3.5 17β -雌二醇抑制TNF-α 诱导的成骨细胞中Caspase3活性改变42-43
• 3.4 小结43-45
• 第四部分 讨论45-53
• 第五部分 结论53-54
• 研究展望54-55
• 参考文献55-62
• 中英文对照表62-64
• 攻读硕士学位期间主要研究成果64-65
• 致谢65

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本文编号：901902