晚期氧化蛋白产物诱导人角质形成细胞凋亡机制的研究

发布时间：2017-09-26 03:23

  本文关键词：晚期氧化蛋白产物诱导人角质形成细胞凋亡机制的研究

  更多相关文章： AOPPs 细胞凋亡 HaCaT细胞 MAPK 氧化应激

【摘要】：研究背景随着生活水平的提高,糖尿病患者的数量迅速增长,糖尿病并发症严重影响患者生存质量。据调查,糖尿病患者中糖尿病足发病率高达25%,糖尿病足的一个主要并发症即为糖尿病慢性创面。糖尿病慢性创面因其治疗时间长、治疗花费高、致残率高等特点给糖尿病患者带来很大困扰。糖尿病慢性创面的发病机制一直是相关领域的研究热点,研究表明,氧化应激在糖尿病患者创面延迟愈合或不愈合的发病机制中起重要作用。氧化应激水平升高的典型表现是机体内活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的增多。细胞内ROS的两个主要来源是NADPH氧化酶(NADPH oxidise, NOX)通路和线粒体呼吸链途径。Claudia A. Benavente在针对人角质形成细胞的研究中发现经NOX通路产生的过多的ROS可显著诱导细胞凋亡。在人体内,NOX具有NOX1-4等多种亚基,其中,在人角质形成细胞中,NOX4的激活对ROS的产生起着非常重要的作用。另一方面,细胞内线粒体可以产生大量的ROS,过量的ROS也会造成线粒体损伤,这会导致线粒体膜完整性的破坏以及DNA损伤,进而表现为线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)的下降以及DNA修复蛋白的表达升高。线粒体损伤可直接促进细胞凋亡,而ROS也可以直接诱导细胞凋亡或通过激活MAP激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路诱导凋亡。近年来,有研究指出氧化应激水平升高可破坏创面局部微环境,而这种破坏作用可通过分布于全身的高浓度氧化应激产物来实现。在糖尿病患者体内已检测出多种氧化应激产物,其中就包括晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products, AOPPs)。已有研究证明,在糖尿病心血管并发症、糖尿病视网膜病变、及糖尿病肾病等并发症的发病机制中,AOPPs通过诱导相关细胞凋亡参与疾病发生发展。Diwesh Chawla及Omur Tabak等研究证实患有糖尿病微血管并发症的患者体内的AOPPs水平较正常人高约2倍,较无并发症患者高近1.5倍。但AOPPs与糖尿病慢性创面的关系还未有报道。我们前期预实验对慢性创面边缘皮肤组织的AOPPs水平进行了检测,实验结果显示：与正常人皮肤组织相比,慢性创面边缘皮肤组织中AOPPs含量明显较高,约为正常皮肤组织的2.75倍。我们首次将AOPPs引入糖尿病慢性创面发病机制的研究中,为进一步探究AOPPs所发挥的作用,我们选取了参与表皮再生的角质形成细胞作为研究对象。希望通过本研究发现并探索AOPPs对人角质形成细胞的作用及其机制,从而为后续研究AOPPs对创面愈合的作用机制及其临床应用提供前期基础。本研究利用人角质形成细胞的替代细胞——HaCaT细胞-—进行离体实验。HaCaT细胞是一种可在体外培养中保持永生化、非肿瘤化的人角质形成细胞系,它完整保留了角质形成细胞的分化能力,并与通过原代培养的细胞具有同等特性。这些特点使得它可代替原代培养细胞被普遍应用于相关研究领域。在此研究中,我们利用体外配制的AOPPs以不同的作用时间或不同的药物浓度刺激正常的HaCaT细胞,检测HaCaT细胞凋亡率及细胞凋亡相关标记物的表达,从而探索AOPPs对角质形成细胞的影响及揭示创面不愈合的潜在反应机制。研究方法1、氧化修饰蛋白AOPP-HSA的制备：PBS溶液溶解人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)配成浓度为20mg/mL的HSA溶液,再将其与40mmol/L的次氯酸钠溶液等体积混合,室温放置30min进行反应。将制备好的AOPP-HSA放入透析袋中,浸没于PBS溶液中,4℃下透析24h,除去游离的次氯酸钠。透析后的AOPP-HSA用微孔滤膜(孔径0.22μm)过滤除菌后,再用Detoxi-Gel内毒素去除胶过滤除去内毒素。将制备好的AOPP-HSA放入-80℃冰箱保存。以氯氨T为标准品,在酸性条件下,测340nm的OD值(光吸收度),用以检测配制AOPP-HSA中AOPPs的含量。用BCA试剂盒测AOPP-HSA蛋白浓度。2、 HaCaT细胞的培养：细胞购自中科院上海细胞库,胰蛋白酶消化游离HaCaT细胞。培养瓶内加入适量DMEM高糖完全培养基(糖浓度4.5g/L,含10%胎牛血清及1%青/链霉素双抗),将HaCaT细胞传代培养,在37℃、含5%C02的细胞培养箱内静置培养。显微镜观察细胞生长情况,每2-3天更新一次培养液,当细胞浓度达到90%时进行细胞传代培养或实验。3、细胞活性的测定：用MTT [Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]法测定AOPP-HSA作用后HaCaT细胞活性。将HaCaT细胞接种于96孔板内,分别用50、100、200、400μg/ml的AOPP-HSA或未经修饰的HSA或DMEM高糖完全培养基200μL培养24h。更换新鲜培养基后,加入10%5mg/mL MTT溶液(溶剂为DMEM完全培养基)培养4h。弃去孔内液体,每孔加入150uL DMSO,振荡溶解甲瓒(MTT结晶物),检测测样品在490nm的OD值,以测定样品中活细胞含量。4、 FACS法检测细胞凋亡：将HaCaT细胞以80%的浓度接种于六孔板中,用50、100、200μg/mL的AOPP-HSA、200μg/mL未经修饰的HSA或DMEM完全培养基培养24h；另用1000μg/mL的AOPP-HSA培养0、15min、30min、45min、1h、2h、6h、12h或24h。利用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒,将处理好的细胞分别重悬于500μL Binding Bufffer中,加入5μL Annexin V-FITC及3μL PI,避光反应10min,用FACSCanto II流式细胞仪进行FL-1 (Annexin V-FITC)及FL-3 (PI)通道的细胞凋亡检测。5、线粒体膜电位的检测：用JC-1 (5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazol-carbocyanine iodide)染色法检测AOPPs作用后HaCaT细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP, △ψm)的变化。将HaCaT细胞接种于共聚焦培养皿中,用50、100、200μg/mL的AOPP-HSA、200μg/mL未经修饰的HSA或DMEM完全培养基细胞培养24h。在每个皿中加入5μg/mL的JC-1染料,37℃培养20min,用PBS溶液润洗细胞,去除游离JC-1染料。用Olympus FluoView FV10i共聚焦激光扫描显微镜观察HaCaT细胞,检测药物处理后细胞MMP变化。6、活性氧ROS的测定：用DCFH-DA荧光探针(二氯荧光黄双乙酸盐,2',7'-dichloro-fluorescin diacetate)测定细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。将HaCaT细胞接种于96孔板中,用10μmol/L的DCFH-DA探针(溶剂为DMEM不完全培养基)避光孵育30min,润洗细胞去除未结合探针,用50、100、200μg/mL的AOPP-HSA、200μg/mL未经修饰的HSA或DMEM完全培养基刺激2h,另用200μg/mL的AOPP-HSA刺激5min、15min、30min、45min、60min、120min,润洗细胞,用酶标仪检测荧光强度(激发波长488nm,发射波长525nm)。再将HaCaT细胞接种于共聚焦皿中,用10μM的DCFH-DA探针避光孵育20min,润洗细胞去除未结合探针,用50、100、200、μg/mL的AOPP-HSA、200μg/mL未经修饰的HSA或DMEM完全培养基刺激2h,润洗细胞,用Olympus FluoView FV10i共聚焦激光扫描显微镜观察荧光强度变化。7、Western blot检测目的蛋白表达：RIPA细胞裂解液处理并收集HaCaT细胞,低温高速离心提取细胞蛋白,与SDS上样缓冲液充分混合。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)方法,以12%浓度凝胶电泳分离蛋白样品,再将蛋白转移至PVDF膜上。用一抗及二抗孵育后,用化学发光法检测蛋白条带发光强度。所用的抗体如下：兔抗NOX4单克隆抗体,兔抗GADPH、PARP、Bcl-2、Bax、caspase3、cleaved caspase3、cleaved caspase9、 p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2多克隆抗体,小鼠抗caspase9多克隆抗体,羊抗小鼠HRP(辣根过氧化物酶)抗体,羊抗兔HRP抗体。8、统计学分析：所有实验均至少重复3次,每个实验指标以均数±标准差(x±s)表示。多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA(单项方差分析)方法,在做两两比较时采用Bonferroni's法。P0.05为有统计学意义。所有统计结果应用统计软件SPSS 13.0完成。研究结果：1、 AOPPs诱导HaCaT细胞凋亡MTT细胞活性检测结果示,在400 μg/mL AOPP-HSA作用下HaCaT细胞存活率在46.72±0.64%,而0-200 μg/mL AOPP-HSA作用下HaCaT细胞存活率大于85%。因此,为探究AOPPs对HaCaT细胞凋亡的影响,实验采用50,100及200 μg/mL浓度的AOPP-HSA对细胞刺激24h或用100μg/mL AOPP-HSA刺激细胞0、15min、30min、45min、1h、2h、6h、12h及24h,并用流式细胞仪检测细胞凋亡率。流式细胞仪检测结果示,NC组(DMEM完全培养基处理组,下同)HaCaT细胞凋亡率为2.70±0.12%,HSA组(未修饰的HSA处理组,下同)HaCaT细胞凋亡率为2.45±0.47%,50ug/mL AOPP-HSA组HaCaT细胞凋亡率为18.59±3.52%,100μg/mL AOPP-HSA组HaCaT细胞凋亡率为20.81±3.14%,200μg/mLAOPP-HSA组HaCaT细胞凋亡率为22.92±4.14%。与未修饰的HSA及DMEM完全培养基相比,AOPP-HSA可显著诱导HaCaT细胞凋亡(P0.05),且随AOPP-HSA作用浓度的升高,凋亡率升高(P0.05)；100μg/mL AOPP-HSA作用于HaCaT细胞后,12h及24h细胞凋亡率显著升高(P0.05),且24h凋亡率(11.77±3.80%)高于12h凋亡率(20.88±2.93%)。2、 AOPPs使HaCaT细胞线粒体膜电位下降正常细胞中MMP维持在相对高水平,JC-1在线粒体内聚集成聚合物(红色荧光),当细胞凋亡时,MMP降低,JC-1以单体形式(绿色荧光)存在细胞质内。本实验中,MMP检测结果提示,与NC组及HSA组相比,AOPP-HSA处理组HaCaT细胞红色荧光减低、绿色荧光增多；随着AOPP-HSA浓度升高,HaCaT细胞红色荧光亮度随之降低、绿色荧光随之增强。这些结果提示,AOPPs可使HaCaT细胞MMP下降。3、AOPPs刺激HaCaT细胞内caspase家族及PARP-1蛋白的表达细胞凋亡过程中,有许多蛋白的表达发生变化,比如Bcl-2家族、caspase家族及PARP-1 。为探究AOPPs刺激后的HaCaT细胞凋亡过程中这些蛋白是否参与反应,我们利用Western blot检测相关目的蛋白的表达情况。检测结果显示：AOPP-HSA作用后30min, PARP-1的表达开始增加,其表达高峰出现在2h(是药物作用前表达量的9.67倍,P0.05)。AOPP-HSA作用后15min,促凋亡蛋白Bax表达开始增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达开始减少,Bax/Bcl-2比值在24h达到最大值(16.71±1.42)。Caspas 9及Caspase 3前体在AOPPs作用后2h开始减少,同时活化的cleaved caspase 9及cleaved caspase 3表达开始增加(P0.05)。随着AOPP-HSA浓度的增力, PARP-1, cleaved caspase 9, cleaved caspase 3及Bax的表达逐渐增多,而Bcl-2的表达逐渐减少(P0.05)。4. AOPPs通过NADPH氧化酶途径促进HaCaT细胞中ROS的生成已有相关研究证明氧化应激反应下,细胞内过多的ROS可促进HaCaT细胞凋亡。为明确作为氧化蛋白产物的AOPPs能否促进HaCaT细胞内ROS的生成,我们对AOPPs作用后的HaCaT细胞进行了胞内ROS水平的检测。检测结果显示,随着AOPP-HSA作用时间的延长或浓度的升高,HaCaT细胞内ROS水平随之增高(P0.05)。NADPH氧化酶(NOX)是ROS产生的主要来源之一,我们分别用NAC(N-acetylcysteine, ROS清除剂)、DPI (diphenylene iodonium,NOX抑制剂)及Apopcynin (NOX抑制剂)预先作用于HaCaT细胞,随后检测AOPPs对细胞内ROS产生的影响。结果显示,NAC, DPI及Apopcynin均可以显著抑制胞内ROS生成,这一结果提示AOPPs可能通过NOX途径促进HaCaT细胞内ROS的生成(P0.05)。5, AOPPs通过NOX4—ROS—MAPK—caspase cascade—PARP-1通路诱导HaCaT细胞凋亡Western blot检测结果示,AOPPs刺激后,HaCaT细胞内NOX4蛋白表达自30min起开始增加、2h时达到高峰(药物作用前的10.42倍,P0.05),p-ERK1/2及p-p38 MAPK从1h开始逐渐增加；且这三种目的蛋白随AOPPs-HSA浓度升高表达逐渐增强(P0.05)。为进一步明确NOX4-ROS-MAPK-caspase cascade-PARP-1通路在HaCaT细胞凋亡中的作用,我们分别用U0126 (ERK上游抑制剂)、SB203580 (p38 MAPK抑制剂)、Z-VAD-fink (caspase广谱抑制剂)、NAC、DPI及Apocynin对细胞进行预处理,western blot检测终末目的蛋白PARP-1的表达。结果显示,在这些抑制剂的保护作用下,AOPPs刺激后的HaCaT细胞凋亡率明显降低(P0.05)、细胞表达的PARP-1蛋白显著减少(P0.05)。结论：1.AOPPs可诱导HaCaT细胞凋亡。2.AOPPs主要通过NOX途径诱导HaCaT细胞产生大量ROS3. AOPPs通过NOX4-ROS-MAPK-caspase cascade-PARP-1通路促进HaCaT细胞凋亡。
【关键词】：AOPPs 细胞凋亡 HaCaT细胞 MAPK 氧化应激
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-26
• 参考文献24-26
• 第一章 AOPPS诱导HACAT细胞凋亡的研究26-49
• 第一节 实验材料26-29
• 第二节 实验方法29-37
• 第三节 实验结果37-44
• 第四节 讨论44-47
• 参考文献47-49
• 第二章 AOPPS刺激HACAT细胞内活性氧产生通路的研究49-65
• 第一节 实验材料49-52
• 第二节 实验方法52-55
• 第三节 实验结果55-61
• 第四节 讨论61-62
• 参考文献62-65
• 第三章 不同层面阻断剂对AOPPS在HACAT细胞内作用的影响65-78
• 第一节 实验材料65-68
• 第二节 实验方法68-71
• 第三节 实验结果71-75
• 第四节 讨论75-77
• 参考文献77-78
• 全文总结78-79
• 缩略语词汇表79-80
• 攻读学位期间成果80-81
• 致谢81-82

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本文编号：921187