高脂血症对小鼠拔牙创早期愈合过程的影响及其分子调控机制的初步研究

发布时间：2017-09-27 15:32

  本文关键词：高脂血症对小鼠拔牙创早期愈合过程的影响及其分子调控机制的初步研究

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【摘要】：目的全身系统状况会影响拔牙创的愈合过程。研究表明,高脂血症不仅是导致心血管疾病的高危因子,还可通过影响成骨细胞及破骨细胞的分化积极参与骨改建的进程。然而,目前关于高脂血症微环境是否会影响拔牙创的愈合过程尚未见明确的研究报道。另外,虽然已有一些研究报道了高脂血症抑制成骨细胞分化的分子生物学机制,仍有大片的未知领域等待进一步的探索。作为Wnt经典信号通路特异性受体的竞争性抑制因子,分泌型卷曲相关蛋白1 (secreted frizzled-related protein 1, SFRP1)可通过调控Wnt信号经典通路在骨代谢过程中起至关重要的调控作用。但目前尚不清楚高脂血症对骨代谢的调控功能是否可通过调控SFRP1实现。为明确高脂血症对拔牙创愈合过程的影响,并初步探索其分子生物学机制,本实验拟选取C57BL/6小鼠和载脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠),通过高脂饮食饲养建立高脂血症小鼠模型,并在自然愈合的条件下,观察高脂血症对拔牙创愈合过程的影响。同时,构建编码SFRP1基因3’非编码区(untranslated regions, UTR)的荧光素酶表达载体,拟用于后续研究明确高脂血症微环境下SFRP1对成骨细胞的分子调控是否受到影响。方法第一部分：选用6周龄雄性C57BL/6小鼠和ApoE-/-小鼠,将小鼠随机分为C57BL/6正常饮食组(WT+S), C57BL/6高脂饮食组(WT+HFD), ApoE-/-正常饮食组(ApoE+S)和ApoE-／-高脂饮食组(ApoE+HFD)四组。分别经正常饮食或高脂饮食喂养4周后,经内眦取血检测血脂水平。在喂养5周后,拔除小鼠双侧下领第2磨牙和第3磨牙。分别在拔牙后第1周和第2周处死小鼠,内眦取血进行血脂水平检测,并分离下颌骨进行HE染色和亚甲蓝染色用于组织学测量,评价新骨形成量及牙槽嵴顶下降高度。第二部分：使用含50 mg/L抗坏血酸的成骨诱导液分别处理MC3T3-E1细胞0、7、10天。提取细胞总RNA,反转录成cDNA后,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参,使用实时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)检测细胞中SFRP1基因的mRNA表达水平。提取细胞蛋白质,以p-肌动蛋白(p-actin)为内参,使用蛋白质印迹法(western blot, WB)检测细胞中SFRP1蛋白的表达水平。使用PCR技术克隆SFRP1基因的YUTR区并连接到荧光素酶报告基因载体pMIR-REPORT上。所构建的新载体命名为pMIR-REPORT-SFRP1UTR.分别将pMIR-REPORT-SFRP 1 UTR和pMIR-REPORT转染至MC3T3-E1细胞和NIH3T3细胞中,检测细胞中荧光素酶的表达水平。结果第一部分：喂养4周后,血清学检测结果显示WT+HFD组血浆中总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-c)的浓度分别是WT+S组的2.2(p0.05)、1.87(p0.05)和1.54(正0.05)倍。而ApoE+HFD组血浆中TC、TG和LDL-c的浓度是ApoE+S组的2.06(p0.05)、3.51(p0.05)和2.52(p0.05)倍。拔牙后1周和2周时,血脂水平的检测结果显示出类似的变化。另外,拔牙后1周时WT+HFD组的新骨形成率低于WT+S组,且差别具有统计学意义(p0.05),而ApoE+HFD组新骨形成率虽然略低于ApoE+S组,但差别无统计学意义(p0.05)。拔牙后2周时,WT+HFD组的新骨形成率显著低于WT+S组(p0.05),而ApoE+HFD组的新骨形成率也显著低于ApoE+S组(p0.05)。通过测量牙槽嵴顶高度降低的程度,我们发现在拔牙后1周和2周时,WT+HFD组的舌侧牙槽嵴顶降低程度均显著大于WT+S组(p0.05),而ApoE+HFD组的舌侧牙槽嵴顶降低程度也都大于ApoE+S组,且差别具有统计学意义(正0.05)。第二部分：成骨诱导0、7及10天后,细胞中SFRP1的mRNA水平分别为1.00±0.12、1.97±0.34和5.00±0.99,诱导10天与0天相比差异均有统计学意义(p0.05)。成骨诱导0、7及10天后,细胞中SFRP1的蛋白水平分别为0.944±0.13、1.26±0.16及1.30±0.15, 诱导7、10天与0天相比差异均无统计学意义(p0.05)。MC3T3-E1细胞中,pMIR-REPORT转染组和pMIR-REPORT-SFRP1UTR转染组的荧光素酶表达量分别为487±34和744±10,二者差异有统计学意义(p0.05)。NIH3T3细胞中,pMIR-REPORT转染组和pMIR-REPORT-SFRP1UTR转染组的荧光素酶表达量分别为2707±117和2240±175,二者差异有统计学意义(p0.05)。结论第—部分：成功在C57BL/6小鼠和ApoE-/-小鼠上建立了饮食干预的高脂血症小鼠模型。高脂血症抑制了小鼠拔牙创新骨的形成,延迟了骨愈合,同时促进了牙槽骨的吸收,加剧了拔牙后的骨丧失。第二部分： 成功构建了编码SFRP1基因YUTR区的荧光素酶表达载体。SFRP1基因的YUTR区参与了SFRP1基因的转录后调控,且这种调控具有一定的细胞特异性。
【关键词】：高脂血症 拔牙创 SFRP1 3'UTR Wnt信号
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R782.11;R589.2
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 中英文缩略词对照表12-13
• 前言13-19
• 第一部分 高脂血症对小鼠拔牙创早期骨愈合的影响19-32
• 材料和方法19-24
• 结果24-27
• 讨论27-31
• 结论31-32
• 第二部分 小鼠成骨细胞中分泌型卷曲相关蛋白1转录后调控机制的研究32-46
• 材料和方法32-40
• 结果40-42
• 讨论42-45
• 结论45-46
• 小结46-47
• 参考文献47-55
• 致谢55-56
• 附录56-57
• 学位论文评阅及况表57

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本文编号：930497