抵抗素对RAW264.7细胞NODs-NF-κB信号通路影响的研究

发布时间：2017-10-06 10:32

  本文关键词：抵抗素对RAW264.7细胞NODs-NF-κB信号通路影响的研究

  更多相关文章： 抵抗素 NOD样受体 炎症 信号通路

【摘要】：目的：抵抗素是新近发现的一种新的脂肪细胞因子,可以促发胰岛素抵抗和介导机体炎性反应。由于尚未在体内找到抵抗素的特异性受体,其在体内一系列调节活动的具体机制目前仍不清楚。NODs (NOD1、NOD2)是天然免疫系统中重要的受体之可以接受内源性信号分子的调控从而诱导无菌炎症。然而,NODs是否作为抵抗素的受体发挥作用,尚未见报道。因此,本试验期望通过研究抵抗素与NODs受体之间的关系,探究抵抗素是否通过NODs-NF-κB信号转导通路发挥其促炎作用。结果：(1)用不同浓度(50ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、200 ng/mL)的抵抗素孵育RAW264.7细胞,培养至预定时间(0h、3h、6h、12h、 24 h)以后,立即收集细胞提取RNA和蛋白并收集细胞上清液,检测NODs及其信号通路下游信号分子RIP2、IKKβ和NF-κB等的基因和蛋白表达水平,细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性细胞因子的含量。结果显示,抵抗素可显著上调RAW264.7细胞中NOD2、RIP2和IKKβ的基因表达水平,而对NOD1基因的表达没有影响。并且,抵抗素显著上调NOD2和RIP2蛋白的表达水平,明显促进NF-κB蛋白向细胞核内转移。抵抗素能显著增加细胞上清液中’TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性细胞因子的含量。(2)用20nM、50nM、80 nM的NOD2-siRNA转染RAW264.7细胞,通过检测NOD2基因和蛋白的表达水平,筛选转染条件。结果显示,80 nM的NOD2-siRNA致使细胞内NOD2的mRNA水平下降了75%,在蛋白表达水平降低60%,符合试验预期。(3)以80 nM的NOD2-siRNA转染细胞,然后加入200 ng/mL的抵抗素孵育细胞,检测NOD2及其下游分子的表达水平。结果显示,NOD2-siRNA+抵抗素组的NOD2和RIP2基因和蛋白的表达水平相比于抵抗素组显著降低；而IKKβ基因表达和NF-κB的核转移过程没有受到显著影响。细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性细胞因子的含量没有受到显著影响。(4)先以25 μmol/L的小白菊内酯孵育RAW264.7细胞1h,然后立即添加200ng/mL的抵抗素继续培养24 h,收集细胞上清液并检测IL-6、IL-1β和TNF-α的表达水平。结果显示,IL-6、IL-1β和TNF-a的含量均显著下降,表明由小白菊内酯通过阻断NF-κB的功能阻止抵抗素引起RAW264.7细胞炎症因子如IL-6、IL-1β和TNF-α的释放。结论：(1)抵抗素能促进RAW264.7细胞中NOD2基因和蛋白的表达,而对NOD1的表达没有影响。(2)在RAW264.7细胞中,抵抗素能通过促进NOD2及其下游信号分子的表达,活化NOD2信号转导通路,发挥促炎作用,但NOD2不是抵抗素的受体。(3) NF-κB是RAW264.7细胞中抵抗素发挥促炎效应的关键转录因子。
【关键词】：抵抗素 NOD样受体 炎症 信号通路
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1;R589.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 缩略词表9-14
• 第一章 文献综述14-27
• 1 抵抗素在代谢与炎症中的研究进展14-22
• 1.1 抵抗素的结构14-15
• 1.2 抵抗素的表达与调控15-16
• 1.3 抵抗素与胰岛素抵抗、肥胖和2型糖尿病16-18
• 1.3.1 抵抗素介导的胰岛素抵抗与糖代谢异常16-17
• 1.3.2 抵抗素介导的胰岛素抵抗与脂代谢异常17-18
• 1.4 抵抗素与机体炎症反应18-19
• 1.4.1 抵抗素与炎症疾病18
• 1.4.2 抵抗素与TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子18-19
• 1.5 抵抗素受体及其信号通路的研究19-22
• 1.5.1 抵抗素与TLR419-20
• 1.5.2 抵抗素与ROR120
• 1.5.3 抵抗素与IGF-1R20-21
• 1.5.4 抵抗素与CAP121
• 1.5.5 抵抗素与Decorin21-22
• 2 NOD1和NOD2在代谢与炎症中的进展22-25
• 2.1 NODs受体的分布23
• 2.2 NODs信号转导23-24
• 2.3 NODs受体联系肥胖、炎症、胰岛素抵抗24-25
• 2.4 NOD1、NOD2与其他疾病25
• 3 研究的目的和意义25-27
• 第二章 抵抗素对NOD1和NOD2基因表达的影响27-42
• 1 材料与方法27-35
• 1.1 材料27-28
• 1.1.1 细胞及主要试剂27-28
• 1.1.2 主要仪器28
• 1.2 试验方法28-35
• 1.2.1 细胞培养28-29
• 1.2.2 试验分组29
• 1.2.3 试验处理和样品收集29
• 1.2.4 NOD1、NOD2、RIP2、IKKβ等基因表达水平的检测29-33
• 1.2.5 NOD1、NOD2、RIP2和NF-κB的蛋白表达水平的检测33-34
• 1.2.6 IL-6、TNF-α和IL-1β等细胞因子水平的检测34
• 1.2.7 统计学分析34-35
• 2. 试验结果35-39
• 2.1 RAW264.7细胞培养结果35
• 2.2 RNA电泳结果35-36
• 2.3 NOD1、NOD2、RIP2及IKKβ mRNA水平检测结果36-38
• 2.3.1 不同浓度抵抗素对NOD1和NOD2基因表达水平影响的结果36-37
• 2.3.2 不同时间点NOD1、NOD2、RIP2及IKKβ mRNA水平检测结果37-38
• 2.4 NOD1和NOD2蛋白的免疫印迹结果38-39
• 2.4.1 不同浓度抵抗素作用下NOD1和NOD2蛋白免疫印迹结果38
• 2.4.2 抵抗素作用不同时间NOD1、NOD2、RIP2和NF-κB免疫印迹结果38-39
• 2.5 细胞上清液IL-6、IL-1β和TNF-α水平的检测结果39
• 3 讨论39-40
• 4 小结40-42
• 第三章 NOD2-siRNA转染条件的筛选42-49
• 1 材料与方法42-44
• 1.1 试验材料42
• 1.2 试验方法42-44
• 1.2.1 细胞培养42
• 1.2.2 siRNA转染细胞42-43
• 1.2.3 试验分组43
• 1.2.4 筛选方法43
• 1.2.5 荧光显微镜下观察转染效果43
• 1.2.6 沉默效率检测43-44
• 1.2.7 NOD2基因沉默效果持续时间的检测44
• 1.2.8 统计学分析44
• 2 试验结果44-47
• 2.1 带荧光标记的siRNA转染细胞观测结果44-45
• 2.2 不同浓度NOD2-siRNA转染下NOD2基因的表达水平检测45-46
• 2.3 不同浓度NOD2-siRNA转染下的NOD2蛋白表达的检测结果46
• 2.4 NOD2-siRNA沉默效果持续时间结果46-47
• 2.4.1 NOD2基因水平的检测结果46-47
• 2.4.2 NOD2蛋白水平的检测结果47
• 3 讨论47-48
• 4 小结48-49
• 第四章 抵抗素对NOD2-NF-κB信号通路的影响49-57
• 1 材料与方法49-51
• 1.1 试验材料49
• 1.2 试验方法49-51
• 1.2.1 NOD2基因沉默后抵抗素对其下游信号分子表达的影响49-50
• 1.2.2 NF-κB核转移在抵抗素信号转导中的作用50-51
• 1.2.3 NOD2、RIP2及IKKβ基因表达水平的检测51
• 1.2.4 NOD2、RIP2和NF-κB蛋白表达水平的检测51
• 1.2.5 细胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α水平的检测51
• 1.2.6 统计学分析51
• 2 试验结果51-54
• 2.1 转染后抵抗素对NOD2及其下游分子表达的影响的检测结果51-54
• 2.1.1 转染后抵抗素对NOD2及其下游分子基因表达影响的检测结果51-52
• 2.1.2 转染后抵抗素对NOD2其下游分子蛋白表达影响的检测结果52-53
• 2.1.3 转染后抵抗素对IL-6、IL-1β和TNF-α表达的检测结果53-54
• 2.2 NF-κB核转移在抵抗素信号转导中的作用的研究结果54
• 3 讨论54-56
• 3.1 关于抵抗素受体及抵抗素对NOD2-NF-κB信号通路的影响54-55
• 3.2 NF-κB核转移在抵抗素信号转导中的作用55-56
• 4 小结56-57
• 结论57-58
• 参考文献58-67
• 致谢67-68
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文68

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