生长抑素对小鼠胰岛移植过程中胰腺外分泌细胞凋亡的作用机制

发布时间：2017-10-06 21:05

  本文关键词：生长抑素对小鼠胰岛移植过程中胰腺外分泌细胞凋亡的作用机制

  更多相关文章： Balb/C小鼠 分离 纯化 胰岛 胰岛细胞 胰腺外分泌细胞 1型糖尿病 共同移植 左肾被膜 生长抑素 胰腺外分泌细胞 TUNEL 胰蛋白酶 凋亡

【摘要】：第一部分Balb/C小鼠胰岛、胰腺外分泌细胞分离、纯化及功能检测目的：Balb/c小鼠胰岛的分离纯化方法：采用逆行胆胰管灌注V型胶原酶的方法来消化分离Balb/C小鼠胰岛,单一浓度梯度淋巴细胞分离液(10771)及倒置显微镜下手工筛选纯化胰岛,DTZ(双硫腙)特异性染色监测胰岛产量及纯度,台盼蓝染色计算胰岛细胞的活性,通过ELISA试剂盒计算胰岛素刺激指数以检测胰岛功能。胰腺外分泌细胞体外功能检测,收集上清液ELISA法测定胰蛋白酶含量。结果：纯化后的每只Balb/C小鼠可获150左右个高质量的胰岛,活性及纯度均大于90%,葡萄糖刺激胰岛素释放试验表明胰岛功能基本正常。胰腺外分泌细胞培养1h,4h后取上清液胰蛋白酶含量为(5.8±1.2) ng/ml, (7.3 ±1.0) ng/ml。结论：应用本课题组成熟的实验方法,能够获得高纯度、高质量的胰岛及胰腺外分泌细胞以满足下一步胰岛移植后续实验的需求。第二部分：Balb/C糖尿病小鼠左肾被膜下纯胰岛移植及与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型的建立目的：掌握本课题组建立Balb/C糖尿病小鼠左肾被膜下纯胰岛移植及与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型的方法及探讨研究胰腺外分泌细胞对移植胰岛的损伤作用。方法：Balb/C雄性小鼠腹腔内注射STZ(链脲佐菌素)诱导成为1型糖尿病小鼠。单纯移植组(n=10)在每只受鼠左肾被膜下移植胰岛细胞团250个,共同移植组(n=10)在每只受鼠左肾被膜上下两极同步移植胰岛细胞团250个和等体积的胰腺外分泌细胞,移植术后持续监测小鼠尾静脉血糖的变化,一个月后左肾切除,免疫组织化学染色法观测抗胰岛素抗体及抗胰蛋白酶抗体的表达。结果：(1)胰岛移植后,共同移植组较单纯组血糖恢复正常时间延迟2-3天,两组移植后的糖尿病小鼠血糖均逐步恢复正常。(2)单纯及共同移植组在肾被膜下可见大量抗胰岛素抗体阳性显色,证实为移植胰岛。共同移植组胰岛细胞团周围可见大量的抗胰蛋白酶抗体阳性颗粒,而单纯移植组未见明显的阳性颗粒。(3)胰腺外分泌细胞和胰岛细胞团共同移植后,证实胰腺外分泌细胞可释放大量的胰蛋白酶损伤移植胰岛的功能恢复。结论：(1)选取诱导糖尿病模型的小鼠体重量大于26g,以1.75mg/kg腹腔内注射可以诱导糖尿病模型。(2)成功建立了胰岛和胰腺外分泌细胞共同移植的动物模型,为后续实验提供前期动物模型准备工作。第三部分：生长抑素对小鼠胰岛移植过程中胰腺外分泌细胞凋亡的作用机制目的：探讨生长抑素如何减轻小鼠胰岛移植过程中胰腺外分泌细胞对移植胰岛的损伤及其促进胰腺外分泌细胞凋亡的作用机制。方法：(1)体外实验：随机选取雄性BALB/C小鼠30只,获取胰岛和胰腺外分泌细胞,随机分组及短期共同培养后,采用流式细胞术仪检测凋亡、测定上清液中胰蛋白酶含量及检测胰岛的胰岛素含量和刺激指数、外分泌细胞及胰岛细胞涂片后采用TUNEL染色检测细胞凋亡和免疫组化测定P53蛋白。(2)体内实验：采用胆总管内逆行灌注胶原酶的方法分别分离、纯化胰腺外分泌细胞和胰岛,分别在小鼠上下极同时移植胰岛250个及与其体积胰腺外分泌细胞,成功建立40只胰岛移植模型,采用随机数字表法分为实验组和对照组,实验组术后腹腔注射生长抑素10ng/g,对照组术后腹腔注射等量生理盐水,持续测定血糖水平及观察生命体征的变化。术后5天摘除小鼠左肾移植物,采用冰冻切片TUNEL染色检测胰腺外分泌细胞凋亡,免疫组化SP技术测定移植物中的胰蛋白酶释放量。结果：(1)流式细胞术结果显示,胰岛细胞实验组和对照组细胞凋亡率分别为(6.76±0.30)%和(6.21±0.40)%,两组对较,差异无统计学意义(P0.05)；生长抑素实验组和对照组细胞凋亡率分别为(21.34±0.34)%和(15.76±0.40)%,两组对较,实验组凋亡率明显高于对照组,差异有统计学意义(P(0.05)；(2)原代培养后上清液中胰蛋白酶的含量ELISA测定：纯化胰岛组上清液中胰蛋白酶浓度为(0.43±1.11)ng/ml,对照组为(5.03 ±1.20)ng/ml,后者明显高于前者,差异有统计学意义(P(0.01);实验组上清液中胰蛋白酶浓度为(2.43±1.30)ng/ml,低于对照组,但高于纯化胰岛组,差异有统计学意义(P(0.05)；(3)原代培养后胰岛素刺激指数的比较：纯化胰岛组胰岛素刺激指数为3.85±1.20,对照组为1.55±1.12,前者明显高于后者,差异有统计学意义(P(0.01);实验组胰岛素释放指数为2.53±1.10,低于纯化胰岛组,但高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)；(4)胰腺外分泌细胞和胰岛涂片的TUNEL结果分析：胰腺外分泌细胞凋亡指数：TUNEL结果表明,实验组胰腺外分泌细胞凋亡指数为(25.37±0.56)%,而对照组胰腺外分泌细胞凋亡指数为(17.68±0.41)%,对照组明显低于实验组,差异有统计学意义(P0.05)；胰岛细胞无统计学差异。(5)细胞涂片免疫组化SP结果显示凋亡细胞呈棕褐色染色,实验组P53染色阳性率为(10.65±0.45)%,对照组P53染色阳性率为(8.32±0.30)%,两组比较,差异有统计学意义(P0.05)。(6)术后5天冰冻切片的TUNEL凋亡检测结果：实验组小鼠的荧光着色的外分泌细胞明显少于对照组。实验组胰腺外分泌细胞凋亡指数为(18.35±0.45)%,而对照组胰腺外分泌细胞凋亡指数为(10.23±0.23)%,对照组明显低于实验组,差异有统计学意义(P0.05)；胰岛细胞凋亡指数无统计学差异。(7)术后5天胰蛋白酶免疫组化结果：对照组中胰岛细胞周围充斥有大量的深棕色的抗胰蛋白酶抗体阳性颗粒,而实验组中未见明显的深棕色显色。对照组阳性颗粒数为(80±4),实验组阳性颗粒数为(15±3),两组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论：(1)生长抑素可以诱导小鼠胰岛移植过程中损伤的胰腺外分泌细胞凋亡,而对胰岛细胞凋亡没有影响。(2)生长抑素可以通过诱导胰腺外分泌细胞凋亡,与凋亡调控基因P53的表达成正相关。(3)在胰岛移植中应用生长抑素可明显减轻小鼠胰腺外分泌细胞对胰岛的损害。
【关键词】：Balb/C小鼠 分离 纯化 胰岛 胰岛细胞 胰腺外分泌细胞 1型糖尿病 共同移植 左肾被膜 生长抑素 胰腺外分泌细胞 TUNEL 胰蛋白酶 凋亡
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1;R657.5
【目录】：

• 个人简历3-5
• 英文缩写一览表5-6
• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-17
• 前言17-20
• 第一部分：Balb/C小鼠胰岛的分离、纯化及功能检测20-32
• 材料及方法20-28
• 结果28-30
• 讨论30-31
• 结论31-32
• 第二部分：Balb/C糖尿病小鼠肾被膜下纯胰岛及与胰腺外分泌细胞移植动物模型的建立32-45
• 材料与方法32-37
• 结果37-41
• 讨论41-44
• 结论44-45
• 第三部分：生长抑素对小鼠胰岛移植过程中胰腺外分泌细胞凋亡的作用机制45-61
• 材料与方法45-51
• 结果51-57
• 讨论57-60
• 结论60-61
• 参考文献61-63
• 综述63-83
• 参考文献75-83
• 致谢83-84
• 在校期间发表的有关论文84

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本文编号：984986