转录因子SOX5通过调控MMP9基因表达影响类风湿关节炎滑膜成纤维细胞迁移和侵袭的研究

发布时间：2017-10-07 03:08

  本文关键词：转录因子SOX5通过调控MMP9基因表达影响类风湿关节炎滑膜成纤维细胞迁移和侵袭的研究

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【摘要】：实验目的：既往认为转录因子SOX5主要参与胚胎发育、细胞周期及软骨形成的调控,而在类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)中的作用尚未见报道。我们前期在RANKL基因启动子区发现一个RA新的易感位点,该位点突变后形成转录因子SOX5结合位点。随后,我们原创性发现SOX5在RA滑膜组织中高表达,能调控滑膜成纤维细胞(Synovial Fibroblasts, SFs)中RANKL高表达,参与RA骨侵蚀。类似于肿瘤细胞的迁移与侵袭性是RA SFs的重要特征,本研究主要探讨SOX5对RA SFs迁移和侵袭特性的影响及其可能的机制。实验方法：1.转录因子SOX5对RA SFs迁移及侵袭能力的影响(1)构建低表达SOX5慢病毒载体转染成纤维细胞,沉默RA SFs中SOX5的表达,采用Transwell小室迁移实验、划痕试验、Transwell小室加基质胶侵袭实验检测沉默S OX5后对RA SFs迁移及侵袭的影响；(2)鬼笔环肽染色探究沉默SOX5对细胞微丝骨架的影响。2.转录因子SOX5调节RA SFs迁移及侵袭机制的研究(1)分别使用SOX5低表达慢病毒载体及重组腺病毒SOX5高表达载体转染RA SFs的细胞系MH7A, Real-time PCR及Western blot检测高表达／低表达SOX5后对MH7A中基质金属蛋白酶(MMPs)表达的影响；(2)将重组MMP9因子加入低表达SOX5的RA SFs中,经Transwell小室迁移实验、划痕试验、Transwell小室加基质胶侵袭实验评估外源性补充MMP9是否可以逆转沉默SOX5对细胞迁移及侵袭的抑制作用。3.转录因子SOX5调控MMP9表达机制的研究(1)在MH7A中过表达SOX5后,采用ChIP实验检测SOX5是否能与MMP9启动子区相结合。(2)构建MP9启动子荧光素酶报告载体,观察过表达SOX5对MP9启动子转录活性的影响。(3)采用Real time-PCR法检测低表达、高表达SOX5后,MH7A中与MMP9相关miRNA的变化；使用miR-15a、16 mimics转染高表达SOX5后的MH7A,反向验证miR-15a、16在SOX5间接调节MMP9中的作用及对MH7A迁移性的影响。4.关节局部沉默Sox5对胶原诱导关节炎小鼠滑膜侵袭性和Mmp9表达的影响建立胶原诱导关节炎小鼠模型(CIA),局部关节注射siRNA-Sox5低表达病毒,Real time-PCR、免疫组化检测关节组织中MMP9的表达；组织病理学观察沉默SOX5对滑膜侵蚀软骨的影响。实验结果：1.转录因子SOX5对RA SFs迁移及侵袭能力的影响在RA SFs中低表达SOX5后,与阴性对照病毒组相比,细胞迁移性和侵袭性显著降低(p0.001),细胞中微丝骨架的重排也明显减弱。2.转录因子SOX5调节RA SFs迁移及侵袭机制的研究在与RA SFs迁移与侵袭相关的MMPs家族中,沉默SOX5能显著抑制MMP2、MMP9表达,其中对MMP9的影响最明显,而对MMP12、MMP3的表达无明显影响；过表达SOX5能显著增强MMP9的表达；外源性加入重组MMP9可部分逆转沉默SOX5对ROSFs迁移及侵袭的抑制作用。3.转录因子SOX5调控MMP9表达机制的研究ChIP结果显示,在MH7A中高表达SOX5可增加SOX5与MMP9启动子区的结合；萤光素酶报告基因结果显示,在MH7A中高表达SOX5可增强MMP9启动子的转录活性；低表达SOX5可以增高MH7A中miR-15a、miR-16的表达,而高表达SOX5可以抑制miR-15a 、miR-16的表达；niR-15a mimics可以抑制高表达SOX5对MH7A中MMP9的诱导作用,抑制MH7A的迁移性。miR-16mimics可以抑制高表达SOX5对MH7 A中MMP9的诱导作用,但对MH7A的迁移性无明显作用。4.关节局部沉默Sox5对胶原诱导关节炎(CIA)小鼠滑膜侵袭性和Mmp9表达的影响在CIA小鼠关节局部沉默Sox5后,关节组织中Sox5及Mmp9的表达明显减低；HE结果显示低表达Sox5组CIA鼠膝关节滑膜对软骨的侵蚀作用明显减轻。实验结论：1.转录因子SOX5可通过调控RASFs中MMP9的表达影响滑膜成纤维细胞的迁移和侵袭能力。2.SOX5可能通过两方面机制调控MMP9表达：SOX5直接与MMP9启动子区结合,调控MMP9的转录；SOX5通过对miR-15a的调控间接影响MMP9的表达。3.CIA鼠关节局部沉默Sox5能显著抑制关节组织中Mmp9的表达,改善滑膜对关节及软骨的侵蚀作用。
【关键词】：转录因子SOX5 类风湿关节炎 滑膜成纤维细胞 迁移与侵袭 基质金属蛋白酶9
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R593.22
【目录】：

• 中英文缩略对照词表6-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-17
• 参考文献15-17
• 第一部分 转录因子SOX5对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞迁移及侵袭能力的影响17-29
• 引言17-18
• 材料与方法18-23
• 实验结果23-26
• 讨论26-27
• 结论27-28
• 参考文献28-29
• 第二部分 转录因子SOX5调节类风湿关节炎滑膜成纤维细胞迁移及侵袭机制的研究29-45
• 前言29-30
• 材料和方法30-39
• 实验结果39-42
• 讨论42-43
• 结论43-44
• 参考文献44-45
• 第三部分 转录因子SOX5调节RASFS表达MMP9机制的研究45-58
• 引言45-46
• 材料与方法46-51
• 实验结果51-55
• 讨论55-56
• 结论56-57
• 参考文献57-58
• 第四部分 关节局部沉默SOX5对胶原诱导关节炎小鼠滑膜侵袭性和MMP9表达的影响58-69
• 引言58-59
• 材料与方法59-64
• 实验结果64-66
• 讨论66-67
• 结论67-68
• 参考文献68-69
• 实验小结69-71
• 综述71-81
• 参考文献77-81
• 致谢81-82

【参考文献】

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1 章平衡;刘健;谈冰;朱福兵;方利;;类风湿性关节炎患者高凝血状态与核因子κB活化及致炎因子增加有关[J];细胞与分子免疫学杂志;2016年03期

2 王亚媛;高薇;王燕;冯欣;;RNA干扰沉默信号转导和转录激活因子3对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖的影响[J];中国全科医学;2013年36期

3 冯森玲;危建安;韩凌;;信号转导和转录激活因子3信号通路在银屑病发病及治疗中的研究进展[J];医学研究生学报;2013年04期

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本文编号：986549