EPS-8沉默和过表达对黑色素瘤细胞A375生物学行为的影响

发布时间：2017-10-15 14:17

  本文关键词：EPS-8沉默和过表达对黑色素瘤细胞A375生物学行为的影响

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【摘要】：背景和目的黑色素瘤(Melanoma)在整个世界范围内是最常见的皮肤、黏膜恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升趋势,严重危害了人类健康。黑色素瘤的恶性程度较高,早期容易出现局部侵袭和远处转移,因此,对其早期发现、早期诊断和早期治疗是治疗黑色素瘤的关键。然而,黑色素瘤发生发展相关分子机制仍然不十分明确,影响了对其早期发现、诊断和治疗。研究与黑色素瘤发生发展以及侵袭转移有关的基因及其表达产物在黑色素瘤发生发展过程中的作用,有助于阐明黑色素瘤侵袭转移调控的具体机制,同时也为黑色素瘤的早期诊断和治疗提供理论依据。表皮生长因子受体通路底物8(epidermal growth factor receptor pathway substrate 8,EPS-8)是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的激酶活性底物之一。EPS-8可作为一个多功能分子参与EGFR相关信号转导,并可在多种酪氨酸酶(包括受体型和非受体型)作用下,发生酪氨酸磷酸化。EPS-8广泛分布于上皮细胞、间质细胞以及造血细胞的细胞质、细胞膜及核膜,其基因定位于染色体的12q23-q24。研究表明,EPS-8的表达及其相关信号转导与多种恶性肿瘤细胞增殖、凋亡和侵袭密切相关。然而,EPS-8在黑色素瘤中的表达及其在黑色素瘤发生发展中的作用及机制仍不明确。本研究的第一章利用组织芯片技术和免疫组织化学法,分析了EPS-8在正常皮肤组织和黑色素瘤组织中的表达;第二章构建EPS-8沉默和过表达质粒载体,运用荧光显微镜观察转染成功率并利用RT-PCR和Western blot检测EPS-8沉默和过表达质粒对EPS-8的干扰效果;第三章运用CCK-8、克隆形成实验、Hochest33258和侵袭实验等检测EPS-8对黑色素瘤细胞A375增殖、凋亡和侵袭能力的变化,旨在探讨EPS-8在黑色素瘤中的表达及其在黑色素瘤发生发展中的作用及机制,为EPS-8成为临床诊治黑色素瘤的靶点提供理论依据。方法1应用组织芯片技术和免疫组织化学S-P法检测EPS-8在18例正常皮肤组织,62例黑色素瘤原发灶组织以及20例黑色素瘤转移灶组织中的表达,分析其与临床病理资料之间的关系。2针对靶基因EPS-8的序列设计了4个sh RNA序列,构建了4个干扰克隆EPS-8-SR1、EPS-8-SR2、EPS-8-SR3和EPS-8-SR4质粒,利用GV248载体构建重组sh RNA质粒;将EPS-8序列插入GV144载体,构建EPS-8过表达质粒。干扰质粒和过表达质粒转化至感受态细胞DH5-α中,酶切和测序检测后,运用Lipofectamine 2000试剂将构建成功的目的基因EPS-8的干扰质粒和过表达质粒转染入黑色素瘤A375细胞。应用RT-PCR和Western blot检测A375细胞中EPS-8基因和蛋白表达水平的变化,筛选出干扰作用最明显的质粒做后续研究。3将实验细胞分为空白对照组(A375-control),阴性对照组(A375-NC),干扰组(A375-RNAi)和过表达组(A375-EPS-8),利用CCK-8和克隆形成实验观察EPS-8对A375细胞增殖能力的影响,Hochest 33258染色法检测细胞凋亡情况,Western blot检测相关蛋白表达水平改变,Transwell实验检测各组细胞的侵袭能力的变化。结果1 62例黑色素瘤原发灶组织中,EPS-8阳性表达38例,阳性表达率61.2%,20例黑色素瘤转移灶组织中EPS-8阳性表达17例,阳性表达率85.0%,18例正常皮肤组织中EPS-8阳性表达3例,阳性表达率16.7%。三者两两比较,差异有统计学意义(P0.05)。黑色素瘤组织中EPS-8的阳性表达与肿瘤的分期、转移有关(P0.05);而与年龄、性别无关(P0.05)。2荧光显微镜观察EPS-8sh RNA序列干扰和过表达质粒瞬时转染黑色素瘤细胞A375,转染率超过60%。转染后A375细胞内EPS-8基因和蛋白表达水平明显改变。利用RT-PCR和Western blot检测,EPS-8-SR3的干扰作用最明显。3 CCK-8实验结果显示,A375-control组、A375-NC组、A375-RNAi组和A375-EPS-8组细胞的增殖率分别为65.31%±11.2%、61.29%±9.8%、28.74%±6.9%和85.67%±8.7%。克隆形成实验结果显示,A375-control组细胞和A375-NC组细胞的克隆形成数目分别为44±4.5和42±3.0,A375-RNAi组细胞的克隆形成数为34±2.7,A375-EPS-8组细胞的克隆形成数为58±3.6。Hochest33258检测表明A375-RNAi组细胞凋亡率为42.3%±3.5%,A375-control组细胞凋亡率为19.1%±2.9%,A375-NC组细胞为18.8%±1.3%,而A375-EPS-8组细胞凋亡率为11.27%±3.5%。Western blot结果显示,A375-RNAi组细胞中促凋亡蛋白Bax水平升高,抗凋亡蛋白Bcl-2水平降低。Transwell侵袭试验结果显示,A375-control组、A375-NC组、A375-RNAi组和A375-EPS-8组细胞穿膜细胞数分别为21.50±3.62、23.20±4.13、13.70±2.85和39.80±5.45。结论1 EPS-8基因在黑色素瘤组织中过表达,且表达水平与黑色素瘤的TNM分期和转移相关。2 EPS-8干扰及过表达质粒转染黑色素瘤A375细胞可明显改变细胞内EPS-8基因及蛋白表达水平。3 EPS-8基因过表达能促进黑色素瘤细胞A375增殖和侵袭,EPS-8基因沉默能促进黑色素瘤细胞A375凋亡,抑制A375细胞增殖和侵袭。EPS-8基因与黑色素瘤细胞A375增殖、凋亡和侵袭有关,EPS-8基因沉默可能对肿瘤的发生发展有抑制作用。
【关键词】：黑色素瘤 表皮生长因子受体通路底物 8 增殖 侵袭
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 英文缩略词表11-13
• 引言13-15
• 第一章 组织芯片检测EPS-8 在黑色素瘤组织中的表达15-24
• 第二章 EPS-8 干扰和过表达质粒的构建、筛选和鉴定24-45
• 第三章 EPS-8 对黑色素瘤细胞A375 增殖、凋亡和侵袭的影响45-56
• 结论56-57
• 参考文献57-60
• 综述60-74
• 参考文献70-74
• 个人简历74
• 研究生阶段发表论文74-75
• 致谢75

【参考文献】

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1 ;中国黑色素瘤诊治指南(2011版)[J];临床肿瘤学杂志;2012年02期

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本文编号：1037581