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EphB4介导皮肤黑素瘤对顺铂耐药的初步分子机制研究

发布时间:2017-10-17 18:46

  本文关键词:EphB4介导皮肤黑素瘤对顺铂耐药的初步分子机制研究


  更多相关文章: 黑素瘤 顺铂 耐药 EphB4 PI3K/MAPK通路 自噬 凋亡


【摘要】:研究背景黑素瘤是恶性程度极高的一类肿瘤,其起源是神经嵴黑色素细胞,占全部恶性肿瘤的1%-3%,常见于皮肤,和皮肤鳞癌、基底细胞癌一起是最主要的皮肤恶性肿瘤,其转移发生时间早,且一旦发生远处转移后,死亡率高达80%,近年来在我国发病率逐渐增加,每年新发病例约2万例,且有明显的家族聚集性。黑素瘤治疗较为棘手,主要问题在于早期症状轻微,难以明确诊断并进行治疗;常在原发病灶出现后不久即迅速发生侵袭转移;黑素瘤对化疗药物不敏感,极易产生耐药,使得对传统化疗药物不起反应而治疗难度加大,目前看来以上原因已成为黑素瘤治疗和预后的最大障碍。尽管目前包括靶向治疗、免疫治疗在内的多种治疗方法在黑素瘤治疗中显现出一定疗效,但受限于临床实际应用,对于晚期已经发生转移的黑素瘤来说,以上方法治疗效果都并不理想,这时人们往往将最后的希望寄托于细胞毒性即化疗药物上。在黑素瘤治疗的“金标准”药物达卡巴嗪广泛应用于临床前,烷化剂类似物顺铂作为常规化疗方案,单独或联合用于包括晚期黑素瘤的许多实体瘤患者的治疗中,并显现出一定疗效。但令人遗憾的是,相比较于其它实体性肿瘤,晚期黑素瘤对顺铂反应性较低,且很快发生耐药,使得顺铂在黑素瘤应用受到限制。长时间以来,人们投入大量精力进行顺铂耐药机制研究,以求尽量延长顺铂在临床使用时间以及扩大其使用范围。目前看来,顺铂耐药机制十分复杂,这其中包括细胞凋亡功能障碍、DNA损伤修复能力增强、重组活化、药物吸收障碍、细胞膜功能状态异常等,其中又以顺铂使用后细胞不能正常发生凋亡而在耐药机制的发生发展中占据重要地位。进一步深入黑素瘤对顺铂耐药发生的机制研究,有利于人们重新掌握对晚期黑素瘤治疗的主动能力,并扩大包括顺铂在内其它相似化疗药物的临床应用范围。本研究拟通过四部分进行,希望能够从新角度来解释黑素瘤对顺铂耐药性发生的部分机制,进而对临床治疗黑素瘤患者产生积极影响。第一章对顺铂耐药A375黑素瘤裸鼠移植模型的建立目的:建立对顺铂耐药的A375黑素瘤裸鼠移植模型(以下简称Cis耐药模型),为后续实验及今后开展相关工作提供良好动物模型。方法:首先,复苏培养具有较强侵袭力的人皮肤a375黑素瘤细胞,动物模型选定balb/c雌性裸鼠,按照4×106a375细胞数量/裸鼠进行接种,约30天后,待其成瘤,按照每组10只裸鼠,共10组进行实验分组,给予顺铂2mg/kg、2次/周对成瘤裸鼠腹腔内注射(ip),持续约40周,待实验结束,观察测量裸鼠体重百分比改变、黑素瘤体积和重量确认cis耐药模型是否建立成功。结果:常规复苏培养a375黑素瘤细胞成功后,进行裸鼠接种,接种后30天左右,可观察到裸鼠荷瘤情况良好,移植瘤体积重量均达到实验要求,裸鼠黑素瘤成瘤模型建立成功;随后建立cis耐药模型,发现实验分组中第3、6组中有裸鼠获得对顺铂耐药性,表现为裸鼠对任何治疗都耐受,形成黑素瘤体积重量明显大于其它对顺铂敏感a375黑素瘤裸鼠模型(以下简称cis敏感模型),另外组间比较并未观察到裸鼠状态变差、体重明显减轻以及急性、迟发毒性症状,表明cis耐药模型建立成功。结论:成功建立了a375黑素瘤裸鼠成瘤模型,经过顺铂长时间诱导后获得cis耐药模型,这为后续实验及今后开展相关研究奠定良好的工作基础。第二章ephb4诱导cis耐药黑素瘤耐药产生目的:制作基因芯片对cis敏感和耐药裸鼠黑素瘤组织进行差异基因谱分析,找出表达差异基因,借此找到针对耐药黑素瘤的新靶点药物。方法:在前期成功获得cis耐药模型基础上,我们成功分离cis敏感和耐药黑素瘤肿瘤组织,提取rna,制作基因芯片,并进行差异基因谱分析,同时比较了常见的多个肿瘤活化相关基因,明确发现cis耐药裸鼠黑素瘤组织高表达ephb4,之后采用ihc法和wb法进行确认;之后较大批量地建立cis耐药模型,随机分为pbs组、cis组、nvp-bhg712组和cis+nvp-bhg712组4组(每组10只),分别接受pbs液(ip,1次/日),2mg/kg顺铂(ip,2次/周),10mg/kgnvp-bhg712(ephb4特异性抑制剂,口服,1次/日)以及顺铂加nvp-bhg712联合治疗组持续给药,待21天药效实验结束后观察测量裸鼠体重百分比改变、黑素瘤体积重量,验证以ephb4作为cis耐药黑素瘤新作用靶点的真实性和可靠性。结果:通过对cis敏感和耐药模型两组黑素瘤组织进行差异基因谱分析,我们明确发现耐药组中ephb4高表达,ihc法和wb法也验证了实验结果真实性。分组实验表明,cis+nvp-bhg712能够对cis耐药黑素瘤产生明显抑制作用。结论:cis耐药黑素瘤高表达ephb4,联合运用顺铂和nvp-bhg712后能够对cis耐药黑素瘤产生最大程度抑制作用。第三章ephb4诱导cis耐药黑素瘤耐药产生机制的初步研究目的:初步探讨ephb4诱导cis耐药黑素瘤耐药性形成机制,比较重要细胞信号通路重关键分子变化,以及信号通路活化后对下游生物学功能如凋亡的影响,明确在cis耐药黑素瘤中存在完整生物信号通路并对耐药性形成产生关键作用;另外,单独或者联合使用顺铂、nvp-bhg712后观察是否对以上信号通路活化产生影响;建立第2、3代对cis耐药模型,并与第1代模型比较,了解cis耐药黑素瘤获得的耐药性是否为稳定表型。方法:wb法检测cis敏感和耐药黑素瘤中信号通路pi3k和mapk活化情况;使用顺铂和nvp-bhg712后,wb法检测pi3k和mapk两条信号通路被抑制的情况;通过tunel染色和annexinv/pi双染色法检测cis敏感和耐药黑素瘤细胞凋亡发生情况;最后我们建立了第2代和第3代cis耐药模型,并分析了第1、2、3代耐药模型中黑素瘤组织ephb4、pi3k和mapk的表达情况,证明建立的cis耐药黑素瘤耐药表型是稳定的。结果:相比较cis敏感黑素瘤,cis耐药黑素瘤表达更高水平p-akt和p-erk;使用cis+nvp-bhg712能够对p-akt和p-erk活化产生最大程度抑制,另外单独使用nvp-bhg712组中p-erk表达明显减弱,ephb4表达在nvp-bhg712组中也出现减弱,说明耐药基因组学的改变是因为顺铂诱导产生的,而不是之前存在耐药细胞亚群;tunel法和annexinv/pi法发现cis耐药黑素瘤细胞凋亡力明显下调,单独使用顺铂或nvp-bhg712都不能增强凋亡,而联合使用顺铂和nvp-bhg712则引发凋亡增强;最后,我们建立了第2、3代耐药模型,结果发现仍对顺铂耐药,wb法发现第2、3代cis耐药黑素瘤组织中ephb4、pi3k和mapk的表达与第1代相似,且黑素瘤生长能力进一步加强。结论:cis耐药黑素瘤组织中p-akt和p-erk发生活化,使用cis+nvp-bhg712能够最大限度地抑制此种活化,同时能够增强黑素瘤细胞凋亡,此外,证实cis耐药模型黑素瘤细胞获得耐药表型是稳定的。第四章自噬在ephb4诱导cis耐药黑素瘤耐药发生中的作用目的:探讨除了上述机制参与黑素瘤对顺铂耐药性形成外,是否还有其它生物学机制参与耐药性的形成,自噬作为细胞一项基本生理功能,是否与耐药性形成相关,值得我们关注。进一步探讨自噬功能改变是否对cis耐药黑素瘤细胞下游凋亡生物学功能产生影响,若有影响,是起促进作用还是抑制作用?这些问题的解答,将有助于我们更深入地了解cis耐药黑素瘤耐药性的形成并对临床治疗耐药黑素瘤提供新思路。方法:MDC法观察Cis敏感和耐药黑素瘤组织自噬发生情况,WB法检测两组自噬蛋白表达情况;MDC法观察PBS组、Cis组、NVP-BHG712组和Cis+NVP-BHG712组自噬形成情况;再次进行药效实验,将裸鼠分为PBS组、3-MA组和Cis+3-MA组(联合使用Cis和3-MA),分别接受PBS液(IP,1次/日),15 mg/kg 3-MA(自噬特异性抑制剂,IP,1次/日)以及顺铂加3-MA联合治疗组持续给药,待21天药效实验结束后观察测量黑素瘤体积变化,以及各实验组凋亡诱导发生和凋亡相关蛋白表达情况。结果:实验发现与Cis敏感黑素瘤相比,耐药黑素瘤自噬形成更强,自噬相关蛋白表达情况也更强;药物干预后,Cis+NVP-BHG712组抑制自噬更强;而使用3-MA后,耐药黑素瘤发生明显抑制,当与顺铂联用时抑制更明显,同时黑素瘤凋亡诱导及凋亡相关蛋白表达都更强烈。结论:自噬参与Cis耐药黑素瘤耐药性形成,且自噬水平同耐药性成正相关,使用Cis+3-MA能够对耐药黑素瘤产生最大程度抑制,也更容易诱导黑素瘤细胞凋亡。全文结论1.成功建立了对顺铂耐药A375黑素瘤裸鼠移植模型,且此耐药为稳定表型;2.Cis耐药模型高表达EphB4,抑制EphB4功能后能够对Cis耐药黑素瘤产生最大程度抑制,这为临床治疗耐药黑素瘤患者提供新的作用靶点;3.EphB4活化引发下游PI3K和MAPK通路激活,并最终引起细胞自噬增强和凋亡功能障碍是EphB4诱导耐药产生的重要机制,这为EphB4诱导黑素瘤对顺铂耐药性提供重要理论基础。
【关键词】:黑素瘤 顺铂 耐药 EphB4 PI3K/MAPK通路 自噬 凋亡
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R739.5
【目录】:
  • 缩略语表5-7
  • 英文摘要7-12
  • 中文摘要12-16
  • 第一章 前言16-23
  • 第二章 对顺铂耐药A375黑素瘤裸鼠移植模型的建立23-31
  • 2.1 引言23-24
  • 2.2 材料与方法24-26
  • 2.3 结果26-28
  • 2.4 讨论28-31
  • 第三章 EphB4诱导Cis耐药黑素瘤耐药产生31-47
  • 3.1 引言31
  • 3.2 材料与方法31-38
  • 3.3 结果38-42
  • 3.4 讨论42-47
  • 第四章 EphB4诱导Cis耐药黑素瘤耐药产生机制的初步研究47-62
  • 4.1 引言47
  • 4.2 材料与方法47-49
  • 4.3 结果49-54
  • 4.4 讨论54-62
  • 第五章 自噬在EphB4诱导Cis耐药黑素瘤耐药发生中的作用62-78
  • 5.1 引言62-63
  • 5.2 材料与方法63-64
  • 5.3 结果64-69
  • 5.4 讨论69-78
  • 全文总结78-79
  • 参考文献79-91
  • 文献综述 EphB4及其配体在肿瘤中的作用概述91-100
  • 参考文献96-100
  • 攻读博士期间发表论文情况100-101
  • 致谢101

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号:1050467

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