梅毒螺旋体鞘蛋白Tp0664经TLR2途径诱导THP-1细胞表达IL-6

发布时间：2017-10-19 03:26

  本文关键词：梅毒螺旋体鞘蛋白Tp0664经TLR2途径诱导THP-1细胞表达IL-6

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【摘要】：目的:构建梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)重组鞘蛋白Tp0664的原核表达载体,在纯化并鉴定表达产物后去除其中的内毒素,初步探讨其诱导THP-1细胞产生促炎细胞因子IL-6的能力。此外,通过研究TLR2负显性质粒、TLR4与TLR5干扰RNA、TLR6负显性质粒、MyD88负显性质粒、ERK特异性抑制剂PD98059、JNK特异性抑制剂SP600125、p38特异性抑制剂SB203580和NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082对Tp0664诱导THP-1细胞产生IL-6的影响,探讨其诱导THP-1细胞产生IL-6是否与TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、MyD88、ERK1/2、JNK、p38和NF-κB介导的信号转导途经有关。方法:从GenBank获取tp0664基因的完整序列,然后设计高特异性引物。提取Tp Nichols标准株DNA,以其为模板,PCR技术扩增tp0664全长基因;构建pET28a-Tp0664原核表达载体,经菌液PCR以及测序鉴定后,将其转化至E.coli BL21(DE3)表达宿主菌中,IPTG诱导重组蛋白Tp0664的表达。采用SDS-PAGE和Western bloting对表达产物进行分析、鉴定;使用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,二喹啉甲酸法测定蛋白浓度;多黏菌素B去除Tp0664中的内毒素后使用鲎试剂测定Tp0664中内毒素含量;Tp0664刺激THP-1细胞,RT-PCR检测IL-6 mRNA转录水平,ELISA双抗体夹心法检测IL-6表达水平,Western bloting检测相关信号分子磷酸化水平。TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和MyD88负显性质粒或干扰RNA转染至THP-1细胞后,Tp0664刺激THP-1细胞,RT-PCR、ELISA和Western bloting分别检测IL-6 mRNA转录水平、IL-6表达水平和相关信号分子的磷酸化水平。erk1/2特异性抑制剂pd98059、jnk特异性抑制剂sp600125、p38特异性抑制剂sb203580和nf-κb特异性抑制剂bay11-7082分别预处理thp-1细胞30min后,tp0664刺激thp-1细胞,rt-pcr、elisa和westernbloting分别检测il-6mrna转录水平、il-6表达水平和相关信号分子的磷酸化水平。结果:成功构建pet28a-tp0664重组质粒,经菌液pcr和测序鉴定后证实插入片段为tp0664基因序列;e.colibl21表达菌在iptg诱导后表达相对分子量mr约为34kda的目的蛋白。经分析,tp0664为可溶性蛋白。ni-nta亲和层析纯化后十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳sds-page证实蛋白纯度95%,mr与目的蛋白大小相符。westernbloting鉴定表明纯化的重组蛋白即为目的蛋白。多黏菌素b处理tp0664后稀释,鲎试剂测定该重组蛋白所含内毒素为0.036eu/ml;不同浓度tp0664(0.5μg/ml~10μg/ml)刺激thp-1细胞均能引起il-6mrna转录水平升高以及il-6表达水平升高,但1.0μg/ml刺激thp-1细胞24h时il-6mrna转录水平最高,1.0μg/ml刺激thp-1细胞48h时il-6表达水平最高。thp-1细胞转染tlr2和myd88负显性质粒后,il-6mrna转录水平和il-6表达水平明显受抑。erk1/2特异性抑制剂pd98059、p38特异性抑制剂sb203580和nf-κb特异性抑制剂bay11-7082预处理thp-1细胞30min后,再以tp0664刺激thp-1细胞,il-6mrna转录水平和il-6表达水平明显受抑,处理组与对照组比较(p0.05)有明显差异。但是,jnk特异性抑制剂sp600125在预处理thp-1细胞30min后抑制tp0664诱导il-6mrna转录以及il-6表达的效果不佳,差异无统计学意义(p0.05)。结论:(1)tp重组鞘蛋白tp0664可诱导thp-1细胞表达促炎细胞因子IL-6;(2)TLR2、MyD88、ERK1/2、p38和NF-κB参与重组蛋白Tp0664诱导THP-1细胞表达促炎细胞因子IL-6。
【关键词】：梅毒螺旋体 重组蛋白 Tp0664 IL-6 信号转导通路
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R759.1
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 主要缩略语英文索引12-14
• 第一章 前言14-18
• 第二章 实验材料18-22
• 1. 实验动物18
• 2. 菌株和质粒18
• 3. 主要仪器设备18-19
• 4. 主要实验试剂及试剂盒19-22
• 第三章 实验方法22-38
• 1. TpDNA提取22
• 2. tp0664全基因序列扩增22-23
• 3. pET28a-Tp0664原核表达载体的构建与鉴定23-26
• 4. Tp0664重组蛋白的表达与鉴定26-27
• 5. 重组蛋白Tp0664的Western bloting鉴定27-28
• 6. 重组蛋白Tp0664纯化以及浓度测定28-29
• 7. 重组蛋白Tp0664免疫新西兰兔后检测抗体效价29-30
• 8. 重组蛋白Tp0664去除内毒素后的内毒素浓度测定30-31
• 9. THP-1 细胞培养31
• 10. 重组蛋白Tp0664刺激实验31
• 11. Western bloting检测蛋白表达以及激酶磷酸化水平31-32
• 12. 瞬时转染与RNA干扰32-33
• 13. DN-TLR2、DN-TLR6和DN-MyD88扩增与转染33-34
• 14. RT-PCR检测IL-6 mRNA转录34-36
• 15. ELISA检测IL-6 分泌36
• 16. MAPKs和NF-κB抑制剂下调Tp0664诱导THP-1 细胞分泌IL-636-37
• 17. 免疫荧光检测p65核转位37
• 18. 统计学分析37-38
• 第四章 实验结果38-60
• 1. tp0664基因的PCR扩增38
• 2. pET28a-Tp0664原核表达载体的PCR鉴定38
• 3. pET28a-Tp0664重组质粒的测序鉴定38-39
• 4. pET28a-Tp0664重组质粒诱导表达条件的优化39-41
• 5. His-tagged Tp0664蛋白的表达与纯化41-42
• 6. 重组蛋白Tp0664的Western bloting鉴定42
• 7. 重组蛋白Tp0664浓度测定42-43
• 8. ELISA检测重组蛋白Tp0664免疫后的兔血清抗体效价43
• 9. 重组蛋白Tp0664内毒素的测定43-44
• 10. 重组蛋白Tp0664刺激THP-1 细胞后mRNA完整性鉴定44-45
• 11. 重组蛋白Tp0664诱导THP-1 细胞表达IL-6 mRNA45-47
• 12. 重组蛋白Tp0664诱导THP-1 细胞分泌IL-647
• 13. Tp0664诱导THP-1 细胞活化ERK1/2、p38和NF-κB47-49
• 14. ERK1/2、p38和NF-κB特异性抑制剂抑制Tp0664诱导THP-1细胞分泌IL-649-53
• 15. ERK1/2、p38和NF-κB特异性抑制剂抑制Tp0664诱导其磷酸化53-54
• 16. DN-MyD88阻断Tp0664诱导THP-1 细胞分泌IL-654-55
• 17. DN-TLR2阻断Tp0664诱导THP-1 细胞分泌IL-655-56
• 18. DN-TLR2抑制THP-1 细胞ERK1/2、p38和NF-κB磷酸化56-57
• 19. NF-κB抑制剂BAY11-7082抑制THP-1 细胞p65核转位57-60
• 第五章 讨论60-64
• 第六章 结论64-66
• 参考文献66-72
• 文献综述72-80
• 参考文献76-80
• 硕士期间科研成果80-82
• 资助项目82-83
• 致谢83

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 谢亚锋;蒋传好;吴移谋;;梅毒螺旋体遗传物质和致病机制的研究进展[J];微生物学免疫学进展;2014年03期

2 ;Production of proinflammatory cytokines in the human THP-1 monocyte cell line following induction by Tp0751,a recombinant protein of Treponema pallidum[J];Science China(Life Sciences);2010年02期

3 韩国柱,邵长庚;我国梅毒流行和临床特点[J];中华皮肤科杂志;2005年05期

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本文编号：1058779