诱导性多潜能干细胞的甲基化检测

发布时间：2017-10-24 23:00

  本文关键词：诱导性多潜能干细胞的甲基化检测

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【摘要】：目的:探讨分化细胞:表皮黑色素细胞(EMC:epidermal melanocytes)、表皮角质形成细胞(EKC:epidermal keratinocytes)、毛囊间质形成细胞(FKC:hair follicles keratinocytes)、耐受胰酶消化的黑素细胞(TE-EMC:trypsinization-enduring epidermal melanocytes)及3因子-诱导性干细胞(3F-i PSCs:3 factors induced pluripotent stem cells)和4F-i PSCs的甲基化程度。方法:1:中性蛋白酶消化包皮组织2小时分离表真皮,再用0.25%胰酶消化表皮10分钟,吹打、中和,获取细胞悬液,然后种植于培养瓶中,待细胞生长密度达80%-90%时,进行差别胰酶纯化,得到纯化的EMC,用培养基M254(含HMGS)培养、传代、扩增;同EMC,获取纯化的EKC,用含HKGS的人表皮细胞培养基培养、传代及扩增;2.0.25%胶原酶处理成年患者头皮的毛囊组织2小时,分离毛囊,再用0.25%胰酶消化15分钟、中和、吹打,获取细胞悬液,用人表皮细胞培养基培养(含HKGS)、传代、扩增:3.TE-EMC:将细胞悬液在0.25%胰酶中处理4小时、中和,更换黑素细胞培养基M254培养(含HMGS)、传代、扩增;4.i PSCs:将携带有Oct4、Klf-4和C-myc 3因子或Oct4、Klf-4、C-myc和Sox-24因子的慢病毒载体,按照MOI值15:1,细胞数4×104/ml,聚凝胺10ng/ml,维生素C10ng/ml,加入M254培养基,终体积为2ml的比例,转染第三代的EMC,24小时后,去除病毒接种于铺满滋养层细胞的鼠尾胶原包被板中,用干细胞完全培养基培养,接种后第12天,培养基更换为1/2完全培养基和1/2条件培养基,20天左右可见明显的3F-i PSCs和4F-i PSCs克隆,挑选克隆,扩增培养。5.提取各组细胞的DNA,采用BSP法检测Oct4和Nanog两个基因位点的甲基化程度。结果:EMC、TE-EMC、3F-i PSCs和4F-i PSCs的甲基化率,在Oct4启动子区域分别为92.5%、83.7%、48.7%、46.6%,Nanog位点则为72.2%、38.9%、44.4%、53.3%,它们之间改变有显著性,但3F-i PSCs和4F-i PSCs间的甲基化程度相似。EKC和FKC的甲基化程度在Oct4位点差异性不明显,而Nanog位点显著。结论:1.3F-i PSCs和4F-i PSCs的甲基化程度相似;2.细胞甲基化程度与细胞来源、形态、分化程度有相关性。
【关键词】：甲基化 表皮细胞 基因启动子区域 亚硫酸氢钠处理后测序法
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R751
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 引言9-11
• 材料与方法11-16
• 结果16-18
• 讨论18-23
• 结论23-24
• 参考文献24-27
• 致谢27-28
• 附录A 英中文术语缩略语对照表28-29
• 附录B 攻读学位期间获取的奖励和科研成果29-30
• 附录C 综述30-38
• 参考文献36-38

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1 苏远婷;诱导性多潜能干细胞的甲基化检测[D];蚌埠医学院;2015年

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本文编号：1090901