一氧化氮在ALA光动力诱导人皮肤鳞癌A431细胞凋亡中的作用研究

发布时间：2017-10-25 03:20

  本文关键词：一氧化氮在ALA光动力诱导人皮肤鳞癌A431细胞凋亡中的作用研究

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【摘要】：目的： 探索5-氨基酮戊酸光动力(5-aminolevulinic acid photodynamic therapy, ALA-PDT)诱导人皮肤鳞癌A431细胞凋亡过程中NO的作用,以深入认识ALA-PDT治疗鳞状细胞癌的分子机制。 方法： 1、培养人皮肤鳞癌A431细胞,CCK-8法检测细胞增殖情况。 2、在最佳ALA孵育浓度1mM,最佳孵育时间点5h时,采用30mW/cm2功率密度的630nm红光作为光源,给予不同光剂量(2J/cm2,4J/cm2)对A431细胞进行ALA-PDT处理,采用磷脂结合蛋白V (Annexin V)/碘化丙锭(PI)双染法通过流式细胞术检测ALA-PDT后不同时间点(4h,12h,20h,24h),人皮肤鳞癌A431细胞凋亡情况。 3、western blot法检测各时间点A431细胞内iNOS的表达情况。 4、Griss法检测ALA-PDT后不同时间点(4h,12h,20h,24h) A431细胞培养上清中NO的释放情况。 5、通过上述实验确定最佳光照剂量及最佳的观察时间点,在ALA-PDT处理的同时分别给予iNOS抑制剂1400w和外源性NO供体SNP, CCK-8法检测各组A431细胞增殖情况,倒置相差显微镜及HE染色后观察凋亡的形态学变化及细胞的嗜酸性变化,同时采用磷脂结合蛋白V (Annexin V)/碘化丙锭(PI)双染法通过流式细胞术检测ALA-PDT诱导人皮肤鳞癌A431细胞的凋亡情况。 结果： 1、成功培养了A431细胞,观察其正常形态并绘制了其生存曲线。 2、流式细胞术检测到ALA-PDT组A431细胞凋亡率随着时间的增加而增加,且光剂量为4J/cmm2时细胞凋亡率较2J/cmm2多,呈一定的时间及剂量依赖性,较其他对照组有明显统计学差异(p0.05)。 3、Griss法检测到ALA-PDT处理后NO水平随着时间的增加而增加,且光剂量为4J/cm2时产生的NO量较2J/cm2多,呈一定的时间及剂量依赖性,较其他对照组有统计学差异(p0.05),且western blot检测到光剂量2J/cm2时ALA-PDT组iNOS的表达量随时间增加而增加。 5、分别给予iNOS抑制剂1400w和外源性NO供体SNP后,ALA-PDT组、ALA-PDT联合1400w组、ALA-PDT联合SNP组及单纯SNP组与单纯ALA组、单纯照光组、空白对照组相比细胞存活率明显降低,有统计学意义(p0.05), ALA-PDT联合1400w组细胞生存率较ALA-PDT组高,而ALA-PDT联合SNP组较ALA-PDT组生存率低,单纯SNP组细胞较ALA-PDT联合SNP组高,差异均有统计学意义(p0.05)。 6、倒置相差显微镜下可见ALA-PDT联合1400w组、ALA-PDT组、ALA-PDT联合SNP组细胞及单纯SNP组细胞与单纯ALA组、单纯635nm红光组及空白对照组相比,细胞皱缩、变圆,ALA-PDT联合SNP组细胞皱缩、变圆程度较ALA-PDT联合1400w组、ALA-PDT组强,ALA-PDT组次之,ALA-PDT联合1400w组相对较弱。 7、HE染色后光镜下可见ALA-PDT联合1400w组、ALA-PDT组及ALA-PDT联合SNP组细胞组、单纯SNP组与单纯ALA组、单纯635nm红光组及空白对照组相比,嗜酸性染色增强,ALA-PDT联合SNP组细胞体积缩小,胞质致密、嗜酸性染色增强程度较ALA-PDT联合1400w组、ALA-PDT组、单纯SNP组强,视野下呈树叶散落状,ALA-PDT组次之,ALA-PDT联合1400w组相对较弱。 8、流式细胞术检测到ALA-PDT组、ALA-PDT联合1400w组及ALA-PDT联合SNP组细胞凋亡率与单纯ALA组、单纯635nm红光组、单纯1400w组及空白对照组相比明显增高(p0.05)。 结论： 1、ALA-PDT可以抑制人皮肤鳞癌A431细胞的增殖；小剂量的ALA-PDT主要通过凋亡方式诱导鳞癌A431细胞死亡,且有一定的时间剂量依赖性； 2、A431细胞株本身可以释放少量的NO,在ALA-PDT治疗过程中NO的产生量增多,且呈一定的时间剂量依赖性,而NO的产生受其上游iNOS合酶的限制,NOS表达量上调可致细胞内源性NO的释放增多,同时可释放到细胞外； 3、NO在ALA-PDT诱导A431细胞的凋亡过程中起着促进用,外源性给予NO供体可与ALA-PDT起着协同作用。
【关键词】：5-氨基酮戊酸光动力疗法 人表皮鳞癌 一氧化氮 诱导型一氧化氮合酶 凋亡 诱导型一氧化氮合酶抑制剂 1400w 一氧化氮供体 SNP
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.5
【目录】：

• ~.略词表4-5
• 中文摘要5-8
• ABSTRACT8-12
• 前言12-17
• 第一部分 研究ALA-PDT诱导人皮肤鳞癌A431细胞凋亡中的NO释放情况及iNOS表达情况17-30
• 引言17
• 材料与方法17-25
• 结果25-28
• 讨论28-30
• 第二部分 初步探索NO在ALA-PDT诱导人皮肤鳞癌A431细胞凋亡中的作用30-41
• 引言30
• 材料与方法30-35
• 结果35-39
• 讨论39-41
• 全文小结41-42
• 参考文献42-47
• 硕士期间发表与待发表文章47-48
• 综述48-57
• 参考文献53-57
• 致谢57-58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：1091837