Caveolin-1在尖锐湿疣角质形成细胞中的表达及与细胞增殖和凋亡的相关性

发布时间：2017-10-31 11:04

  本文关键词：Caveolin-1在尖锐湿疣角质形成细胞中的表达及与细胞增殖和凋亡的相关性

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【摘要】：研究背景和目的：尖锐湿疣是由人乳头瘤病毒感染引起的皮肤和黏膜良性赘生物,好发于性活跃的中青年,是临床最常见的性传播疾病之一。近年来,其发病率不断上升。尖锐湿疣具有潜伏期长、传染性强、生长迅速、反复发作、治疗迁延等特点,部分患者短期内因疣体过度增殖而形成巨大型尖锐湿疣,少数亦有恶变的可能,对社会和家庭危害极大,严重影响患者的身心健康,因此研究其发病机制对于尖锐湿疣的防治具有十分重要的意义。目前大量研究证实角质形成细胞的过度增殖和异常凋亡是尖锐湿疣发病的主要环节,但具体的发病机制目前仍未明确。Caveolae是细胞质膜表面特异性的60-80nm大小内陷微区,主要介导细胞的内化和胞吞转运,并且是细胞信号转导的信使中心,是细胞膜上对细胞外的信号分子的识别、分隔和传导的中心区域。Caveolin-1是Caveolae上的主要结构蛋白和标志性蛋白,介导Caveolae结构的形成。Caveolin-1基因定位于人类染色体7q31.1-31.2。Caveolin-1蛋白分子量为22kD,由178个氨基酸组成,其结构主要包括中央高度保守的疏水区和两侧可变的N端、C端区域,在细胞膜内具有特殊的发夹样结构。Caveolin-1蛋白广泛存在于许多高度分化的细胞,如上皮细胞、内皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等。Caveolin-1蛋白N端的一段氨基酸序列如同形成的脚手架,又称为脚手架区域。Caveolin-1的脚手架区域能够与多种位于质膜的信号分子蛋白结合,包括表皮生长因子受体,内皮一氧化氮合酶,整合素,神经生长因子等,实现对信号转导通路的调控。Caveolin-1在很多生理、病理活动中扮演着重要的角色,不仅参与细胞增殖、凋亡、分化、迁移及血管的生成,并且与病原体感染、糖尿病、动脉粥样硬化、系统性硬化及肿瘤的发生、发展、浸润、转移等过程也密切相关。其中Caveolin-1与细胞增殖,凋亡的关系是目前研究的热点,已有大量研究证实Caveolin-1可调控多种细胞的增殖和凋亡,其表达的改变参与了多种疾病的发病。并且在许多疾病中,Caveolin-1蛋白的表达水平与患者的临床数据具有密切相关性,Caveolin-1蛋白可作为判断病情一个生物学标记。Caveolin-1在尖锐湿疣中表达是否发生改变?是否参与了角质形成细胞的异常增殖、凋亡以及尖锐湿疣的发病?其表达水平与尖锐湿疣患者各临床参数有何关系?这一系列问题目前国内外未见有关研究报道。本课题第一部分检测Caveolin-1在尖锐湿疣角质形成细胞中的表达,并与正常皮肤进行对比。再分析Caveolin-1的表达量与尖锐湿疣患者各临床参数的关系,旨在研究Caveolin-1是否参与尖锐湿疣的发病,并判断其是否可作为判断病情的一个生物学标记。本课题第二部分通过比较尖锐湿疣和正常包皮角质形成细胞的增殖指数和凋亡指数,并分析尖锐湿疣角质形成细胞中Caveolin-1的表达与增殖指数、凋亡指数的相关性,旨在探讨Caveolin-1在尖锐湿疣发病中的作用机制。本课题第三部分通过RNA干扰技术,下调人角质形成细胞系Hacat细胞中Caveolin-1的表达,研究下调Caveolin-1表达对Hacat细胞增殖,凋亡的影响,旨在进一步明确Caveolin-1蛋白与角质形成细胞增殖,凋亡的关系。研究方法：1.收集尖锐湿疣患者的组织标本和临床资料。通过免疫组化法来检测尖锐湿疣角质形成细胞中Caveolin-1蛋白的表达和分布；通过Image-Pro Plus 6.0软件对角质形成细胞染色进行分析,计算其平均吸光度,来对Caveolin-1蛋白的表达进行半定量量化。通过中性蛋白酶消化,分离出尖锐湿疣新鲜皮损中的表皮部分,用western blot进一步验证尖锐湿疣角质形成细胞中Caveolin-1蛋白的表达水平；用荧光定量real-time PCR检测尖锐湿疣角质形成细胞中Caveolin-1 mRNA的表达水平。最后分析Caveolin-1蛋白的表达水平与尖锐湿疣患者各临床参数的相关性。取正常成年男性包皮组织作为对照。2.通过免疫组化法标记增殖细胞核抗原(PCNA),来检测尖锐湿疣中增殖的角质形成细胞,并计算其增殖指数；通过末端标记法(TUNEL)来检测尖锐湿疣中凋亡的角质形成细胞,并计算其凋亡指数。分析尖锐湿疣角质形成细胞中Caveolin-1蛋白的表达与其增殖指数、凋亡指数的相关性。取正常成年男性包皮组织作为对照。3.设计三条针对Caveolin-1基因的siRNA,用脂质体转染法将siRNA导入Hacat细胞。用荧光定量real-time PCR方法来筛选出抑制效果最佳的那条siRNA,以及最佳的起效浓度。用筛选出的最有效siRNA在最佳起效浓度下转染Hacat细胞,并设为实验组；转染非特异序列的Hacat细胞为阴性对照组,未转染的Hacat细胞为空白对照组。通过western blot和免疫荧光验证转染siRNA后Hacat细胞中Caveolin-1蛋白表达的改变。MTS法分别检测干扰Caveolin-1基因24h、48 h、72h后Hacat细胞增殖的变化。流式细胞仪(FCM)检测干扰Caveolin-1基因48 h后Hacat细胞凋亡的情况。4.统计学分析：采用SPSS20.0软件进行分析,数据以x±s来表示。Caveolin-1的表达、增殖指数和凋亡指数的比较采用两独立样本t检验。Caveolin-1的表达与尖锐湿疣患者临床数据的关系的分析采用两独立样本的t检验(临床参数的分类为2类)或者单因素方差分析(临床参数的分类大于2类)。Caveolin-1的表达与增殖指数、凋亡指数的相关性分析采用Pearson相关分析。3组细胞之间的比较采用单因素方差分析(组间均数多重比较采用LSD法)。采用双侧检验,P0.05为差异有统计学意义。结果：1. Caveolin-1在尖锐湿疣角质形成细胞中的表达及与各临床参数的相关性：1.1免疫组化结果显示：Caveolin-1蛋白在角质形成细胞中呈胞浆和胞膜表达,并且在尖锐湿疣和正常皮肤的角质形成细胞中均有表达。但在尖锐湿疣组中,Caveolin-1蛋白表达主要位于基底层的角质形成细胞,棘层和颗粒层的角质形成细胞呈弱表达或无表达,而在正常皮肤组中则为表皮全层表达。尖锐湿疣组和正常皮肤组中角质形成细胞Caveolin-1蛋白的平均吸光度分别为0.042±0.021和0.181±0.075,差异有统计学意义(t=,P0.001)。1.2 western blot结果显示：与正常表皮相比,尖锐湿疣组织表皮中的Caveolin-1蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(t==7.533,P0.05)。1.3荧光定量real-time PCR结果显示：与正常表皮相比,尖锐湿疣表皮中的Caveolin-1 mRNA表达显著降低,差异有统计学意义(t=4.135,P0.05)。1.4 Caveolin-1蛋白表达与临床参数的相关性显示：尖锐湿疣患者皮损中角质形成细胞的Caveolin-1蛋白表达与患者的性别,年龄,初发/复发,部位,病程,HPV类型和治疗后是否复发等均无显著相关性(P均0.05)。2.尖锐湿疣角质形成细胞中Caveolin-1的表达与细胞增殖指数,凋亡指数的相关性：2.1 PCNA免疫组化结果显示：尖锐湿疣组中增殖的角质形成细胞在表皮全层均可见,增殖指数为(65.63±19.86)%。正常皮肤组中增殖的角质形成细胞主要位于基底层和棘层下部,增殖指数为(23.51±4.00)%,两者之间差异有统计学意义(t=12.44,P0.001)。相关分析显示,尖锐湿疣组中角质形成细胞的增殖指数与Caveolin-1表达呈显著负相关(r=-0.798,P0.05)。2.2 TUNEL结果显示： 尖锐湿疣组中凋亡的角质形成细胞位于表皮全层,其凋亡指数为(24.12±10.86)%。正常皮肤组中凋亡的角质形成细胞散在分布于表皮上部,其凋亡指数为(3.13±1.12)%,两者之间差异有统计学意义(t=11.97,P0.001)。相关分析显示,尖锐湿疣组中角质形成细胞的凋亡指数与Caveolin-1表达呈显著正相关(r=0.825,P0.05)。3.下调Hacat细胞中Caveolin-1表达对细胞增殖,细胞凋亡的影响：3.1荧光定量real-time PCR筛选结果： 三条针对Caveolin-1特异性的siRNA中,siRNA-2在浓度为25nM下抑制效果最佳,成功将Hacat细胞中的Caveolin-1表达降低了84.32%。3.2 Western blot结果显示：转染干扰效果最佳的siRNA后,实验组Hacat细胞Caveolin-1的表达显著低于空白对照组和阴性对照组(P0.05)。3.3免疫荧光结果显示：实验组Hacat细胞Caveolin-1的荧光强度显著低于空白对照组和阴性对照组。3.4 MTS结果显示：实验组Hacat细胞在转染24h,48h和72h后的吸光度A分别为0.563±0.013,0.628±0.006和0.811±0.018,高于空白对照组(0.541±0.009,0.575±0.012和0.722±0.004)和阴性对照组(0.536±0.006,0.571±0.015和0.719±0.002),差异均有统计学意义(P均0.05),空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P0.05)。3.5流式结果显示：转染48h后,实验组的Hacat细胞的凋亡率为(8.90%±0.06%),低于空白对照组(20.59%±0.87%)和阴性对照组(20.64%±0.09%),差异有统计学意义(P均0.05),空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P0.05)。结论：尖锐湿疣中角质形成细胞的Caveolin-1蛋白和mRNA表达水平,与正常皮肤相比,均显著下降；Caveolin-1蛋白表达水平与尖锐湿疣患者的临床数据未见明显相关性；尖锐湿疣中角质形成细胞Caveolin-1蛋白的表达与其增殖指数呈负相关,凋亡指数呈正相关；下调角质形成细胞Caveolin-1蛋白的表达能够促进其增殖,抑制其凋亡。尖锐湿疣中角质形成细胞的Caveolin-1表达的下降,可能导致角质形成细胞增殖加快,细胞凋亡减少,参与尖锐湿疣的发病。
【关键词】：尖锐湿疣 Caveolin-1 角质形成细胞 细胞凋亡 细胞增殖
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R752.53
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-20
• 主要试剂和仪器20-24
• 第一章 Caveolin-1在尖锐湿疣角质形成细胞中的表达及与临床资料的关系24-41
• 1. 实验方法24-34
• 2. 结果34-38
• 3. 讨论38-41
• 第二章 尖锐湿疣角质形成细胞中Caveolin-1的表达与细胞增殖指数,凋亡指数的相关性41-50
• 1. 实验方法41-44
• 2. 结果44-48
• 3. 讨论48-50
• 第三章 下调Hacat细胞中Caveolin-1表达对细胞增殖和细胞凋亡的影响50-69
• 1. 实验方法50-63
• 2. 结果63-67
• 3. 讨论67-69
• 全文总结69-70
• 参考文献70-75
• 缩略语/符号75-76
• 硕士阶段发表论文情况76-77
• 致谢77-78

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本文编号：1122055