溶血磷脂酸活化初级感觉神经元参与胆汁淤积性瘙痒症及其机制研究

发布时间：2017-11-01 12:17

  本文关键词：溶血磷脂酸活化初级感觉神经元参与胆汁淤积性瘙痒症及其机制研究

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【摘要】：慢性瘙痒症是一种临床常见的、有时令人难以忍受的自觉症状,通常伴随着多种系统性疾病的发生,例如:慢性肝胆系统疾病、慢性肾功能衰竭、恶性肿瘤、全身性感染、多种内分泌及血液系统疾病等。近些年以来,随着人们生活水平的提高,大家对慢性瘙痒症的关注度越来越高,相关领域的研究也逐年增加。最近发现了一些特异性的瘙痒神经通路,包括一些新的瘙痒介质以及它们的一些相应受体,但是,慢性瘙痒症的具体发病机制仍然不是十分清楚,故一直找不到行之有效的治疗方法。近年来,脂质代谢功能障碍是临床研究的一个重点和热点。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)在脂质代谢过程中,作为一种重要的中间产物,正越来越受到人们的关注,其主要由血小板、脂肪细胞和成纤维细胞等分泌,在多种疾病中,通过多种信号转导通路发挥着重要的生物学作用。最近,Kremer等的研究发现在慢性胆汁淤积性瘙痒患者的血清中,找到了一种新型的致痒介质溶血磷脂酸(LPA),其异常升高已被证实为引起慢性胆汁淤积性瘙痒的一个重要原因。又有研究表明,有一类特异性表达在小鼠背根神经节神经元的肥大细胞相关的G蛋白偶联受体A3(Mas-Related G-coupled Protein Receptor,MRGPRA3)与化学性瘙痒有密切关系,该受体激动剂为氯喹。MRGPRA3阳性神经元与常规的组胺依赖性瘙痒行为密切相关。尽管这类伤害性感受器在介导急性瘙痒刺激中发挥了一定作用,但是仍然不清楚在慢性胆汁淤积性瘙痒病理情况下,这类神经元的兴奋性是否发生改变。经过以上推论,我们可以假设,在胆汁淤积性瘙痒症中,LPA可能激活了痒觉特异性MRGPRA3阳性神经元,通过与其中的某型LPA特定受体相结合,从而使相关神经元兴奋性增加,产生自发性搔抓行为。在本研究的实施过程中,我们首先使用雄性C57小鼠建立胆总管结扎模型,观察BDL手术后,在不同的时间点,小鼠自发性搔抓行为次数的改变。然后,原代培养背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)神经元,在给予LPA刺激后,观察LPA对小直径DRG神经元胞内钙离子浓度的改变,以及对细胞膜兴奋性的改变。接着,使用分子生物学方法研究参与LPA致痒的受体分型,并使用相应基因敲除小鼠进一步确认LPA与受体的相互作用。最后,使用MRGPRA3转基因小鼠,通过在体电生理实验方法,明确LPA与MRGPRA3阳性神经元相关的细胞作用机制。实验结果如下:1.胆汁淤积性小鼠自发性瘙痒的搔抓次数增加动物行为学结果显示,随着胆总管结扎时间的延长,与对照组小鼠相比,胆汁淤积型小鼠在胆总管结扎术术后出现一定次数的自发性瘙痒行为,在术后第10天,1小时内胆汁淤积症诱发的自发性瘙痒抓挠行为达到峰值,然后开始逐渐下降,并观察到第14天结束。2.LPA增加小直径神经元胞内钙离子水平与细胞膜兴奋性分别对假手术组与BDL组模型小鼠的DRG神经元进行原代培养,通过使用钙成像技术(钙离子成像的比率计),分别比较在LPA刺激后,不同模型组间DRG小直径神经元胞内钙离子对LPA反应性改变的差异,我们发现与假手术组小鼠的DRG小直径神经元相比,胆总管结扎手术组小鼠的DRG小直径神经元中的阳性反应细胞,所引起的钙离子反应幅度的增加比例更高,具有显著的统计学意义。而且,假手术组小鼠的DRG小直径神经元对LPA有反应的阳性细胞数百分比大约为21.2%左右,相反,对于胆总管结扎手术组小鼠的DRG小直径神经元,其对LPA有反应的阳性细胞数百分比显著增加,达到46.2%左右,具有显著的统计学意义。以上这些结果可以说明,与假手术组相比,在胆总管结扎术后,LPA能引起小鼠DRG神经元中介导伤害性感觉的小直径神经元对LPA有反应的阳性细胞比例增加,胞内钙离子反应幅度也增加,且增加的钙离子部分是由于胞外的游离钙进入细胞内所引起的。局部使用LPA能够使DRG小直径神经元的静息膜电位(RMP)引起明显放电,具有显著的统计学意义。而且,细胞膜去极化能够使这些有反应的神经元诱发动作电位(AP)放电。在LPA处理的过程中,平均输入电阻(Rin)显著降低,基强度降低,2倍基强度诱发的动作电位数量增加,具有显著的统计学意义,这表明静息离子通道的开放增加。以上结果表明,LPA能直接激活胆总管结扎模型组小鼠的初级感觉神经元。3.LPA通过LPA4型受体增加搔抓行为、胞内钙离子水平与细胞膜兴奋性使用Real-time PCR法来检测BDL术后小鼠脊髓背根神经节中不同亚型的溶血磷脂酸受体(LPAR1-6)的表达水平。PCR检测结果发现,与假手术组小鼠相比较,BDL术后10天小鼠LPAR4型受体m RNA表达水平明显升高,且具有统计学意义,然而LPAR1-3,5,6型受体并没有统计学意义上的差异。对LPAR4基因敲除小鼠进行同样的胆总管结扎术操作,与野生型小鼠相比较,LPAR4基因敲除小鼠在胆总管结扎术后的第10天到第14天,自发性瘙痒搔抓行为计数明显减少。局部使用LPA刺激LPA4-/-的小直径神经元,与假手术组相比,胆总管结扎组LPA4-/-小鼠的DRG小神经元对LPA反应阳性的百分比显著降低,有明显的统计学意义。而且,与野生组小鼠相比,LPA引起的LPA4-/-组小鼠小神经元胞内钙离子反应的阳性反应细胞数目和增加幅度均显著减弱。我们又发现,与野生型小鼠相比,LPA引起LPA4基因敲除小鼠静息膜电位的去极化明显减弱,平均输入电阻(Rin)增加,基强度增加,两倍基强度诱发的动作电位数目减少。4.LPA通过LPA4介导MRGPRA3痒觉神经元参与的胆汁郁积症性瘙痒症使用Mrgpr A3+转基因小鼠,原代培养神经元,局部使用LPA能引起胆总管结扎模型组小鼠Mrgpr A3阳性神经元胞内钙离子反应显著性增加。通过在体电生理技术,局部使用LPA能引起BDL组Mrgpr A3+神经元兴奋性增加。综上所述,通过本研究,我们发现胆汁淤积性小鼠自发性瘙痒的搔抓次数增加。同时,我们发现LPA与LPA4受体特异性结合,局部使用能够增加神经元胞内钙离子反应的阳性反应细胞数目、反应幅度和细胞膜的兴奋性,LPA所致的胆汁淤积性瘙痒症中部分是由氯喹参与的,属于非组胺依赖性瘙痒,与临床上的“使用抗组胺药来治疗胆汁淤积性瘙痒症无效”这一观点基本保持一致。而且,我们又发现LPA是通过LPA4受体介导MRGPRA3痒觉神经元参与的胆汁郁积症性瘙痒症。
【关键词】：胆汁淤积性瘙痒 溶血磷脂酸 脊髓背根神经节 MrgprA3阳性神经元
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R758.31
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 缩略词表12-14
• 前言14-17
• 第一部分 小鼠胆汁淤积性瘙痒症的在体行为与离体细胞研究17-39
• 材料与方法17-25
• 结果25-35
• 讨论35-39
• 第二部分 LPA4受体参与胆汁郁积症性瘙痒症的离体机制研究39-53
• 材料与方法39-46
• 结果46-52
• 讨论52-53
• 第三部分 MRGPRA3痒觉神经元介导胆汁郁积性瘙痒症的机制研究53-64
• 材料与方法53-60
• 结果60-62
• 讨论62-64
• 全文小结64-65
• 参考文献65-74
• 综述74-88
• 参考文献83-88
• 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明88-91
• 致谢91

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本文编号：1126794