PCBP1在皮肤鳞状细胞癌干细胞维持中的作用研究

发布时间：2017-11-10 00:33

  本文关键词：PCBP1在皮肤鳞状细胞癌干细胞维持中的作用研究

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【摘要】：目的：研究皮肤鳞状细胞癌(Skin squamous-cell carcinoma, SCC)干细胞维持过程中多聚胞嘧啶结合蛋白PCBP1的表达,并在体外和体内验证其对SCC发生发展的作用,进一步研究调控PCBP1在SCC干细胞维持过程中表达抑制的内在分子机制。方法：1、采取无血清成球培养法从SCC细胞系COLO-16富集肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells, CSCs),使之继续增殖、去分化、建立较为稳定的CSC细胞,利用流式细胞技术和免疫荧光技术验证细胞内肿瘤自我更新标志物和干细胞标志物的表达情况,判断CSC建系是否成功.2、将上述CSC细胞正常连续培养3天,分别收取每天CSC细胞的RNA和总蛋白,利用定量PCR和免疫印迹实验检测CSC干性维持过程中PCBP1的表达变化。3、构建PCBP1过表达的CSC细胞系和对照细胞系,通过软琼脂克隆形成实验和裸鼠成瘤实验阐述PCBP1在SCC发生发展中的作用。4、利用生物信息学工具Targetscan发现PCBP1基因3'-UTR区域含有较为保守的微小NA-490-3p(miR-490-3p)种子序列,利用定量PCR验证miR-490-3p在CSC干性维持过程中的表达情况。5、富集多核糖体结合的mRNA,检测翻译依赖性的PCBP1 mRNA表达,确认PCBP1在CSC干性维持中表达下降的调控层面。6、构建包含PCBP1基因3'-UTR区域的萤光素酶报告基因质粒及对应的突变质粒,验证miR-490-3p表达改变对PCBP1的直接调控。7、进一步在20例临床SCC组织样本中检测miR-490-3pp和PCBP1的表达,分析二者表达的相关性。结果：1、我们从COLO-16细胞系中成功富集、扩增得到CD34阳性的CSC细胞,干细胞标志物如CD44、SSEA4、TR1-60、和TR1-81都呈阳性表达。2.发现在CSC干性维持过程中,PCBP1基因mRNA水平表达较为稳定,但随CSC细胞培养时间延长,PCBP1蛋白表达显著下降。3、在上述获得的CD34+CD44+CSC细胞中过表达PCBP1,可显著抑制其在体外的增殖能力和裸鼠体内成瘤能力.4、发现miR-490-3p可靶向PCBP1基因3'-UTR,在CSC干性维持过程中miR-490-3p表达呈逐渐增加趋势。5、多核糖体结合的iRNA中,PCBP1在CSC干性维持后期表达下降,证实其蛋白表达下降的机制是转录后的翻译水平调控。6、PCBP1 3'-UTR体外荧光素酶报告基因实验证实miR-409-3p的表达高低可直接影响萤光素酶活性,即PCBP1是miR-490-3p的真实靶点。7、SCC组织样本中也发现miR-490-3p表达异常增加、PCBP1表达下降,二者表达呈负性相关。结论：PCBP1在SCC干细胞维持过程中蛋白表达下降,可抑制SCC体外增殖和体内成瘤能力,其表达受到上游niR-490-3p的负向调控,二者在SCC组织中表达呈负相关。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.5

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本文编号：1164310