Gateway技术构建人RhoD慢病毒表达载体及转染人黑素瘤A375细胞株

发布时间：2017-11-26 11:02

  本文关键词：Gateway技术构建人RhoD慢病毒表达载体及转染人黑素瘤A375细胞株

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【摘要】：目的构建人RhoD基因的慢病毒载体并进行慢病毒包装和鉴定,转染人黑素瘤细胞A375,使其过表达RhoD蛋白,为后续研究RhoD在黑素瘤中的作用奠定基础。方法 Gateway技术构建携带增强型绿色荧光蛋白EGFP的RhoD慢病毒载体,经PCR及基因测序鉴定后,与辅助质粒p LV/helper-SL3,pLV/helper-SL4及p LV/helper-SL5混合采用脂质体法制备DNA-Lipofectamine 2 000复合物,并共同转染293FT细胞进行慢病毒包装,产生相应慢病毒颗粒,通过定量PCR方法测定病毒滴度。包装好的慢病毒转染人黑素瘤A375细胞,荧光显微镜下观察荧光表达情况,流式细胞仪检测转染效率;实验分为A375(未处理对照组)、A375-EGFP(不含目的基因的空病毒对照组)和A375-RhoD(含RhoD基因的病毒组)三组,采用实时荧光定量PCR(QPCR)及免疫印记法(western blotting,WB)验证RhoD在A375-RhoD组细胞中的过表达。结果通过PCR、基因测序证实,慢病毒表达载体pLV[Exp]-EGFP/NeoCMVh RhoD构建成功。与辅助质粒共转染293FT细胞包装出具高效感染力的慢病毒,经测定病毒滴度为(5.13±2)×10~8TU/m L。转染A375细胞后可见明显的绿色荧光表达,流式检测转染效率大于80%;A375-RhoD组RhoD mRNA及蛋白水平均较A375-EGFP组和A375组细胞中明显增高。结论成功构建RhoD慢病毒表达载体,包装出具高效感染力的慢病毒颗粒并成功转染人黑素瘤A375细胞,为进一步研究RhoD在黑素瘤中的作用提供实验基础。
【作者单位】： 中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所病理科;中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所江苏省皮肤病性病分子生物学重点实验室;
【基金】：国然自然科学基金(81272992) 江苏省临床医学科技专项-医学研究中心项目(BL2012003) 江苏省自然科学基金(BK20131063) 2012年高等学校博士学科点专项科研基金(20121106110040)
【分类号】：R739.5
【正文快照】： efficiency was higher than 80%.Rho D m RNA and protein levels in Rho D overexpression cells(A375-Rho D)were significantly higher than that in cells infected by Lentiviral vector only expressing EGFP(A375-EGFP)and no infected cells(A375).Conclusion The re，

本文编号：1229544