Cbl-b基因沉默对TRP-2肽疫苗免疫小鼠淋巴细胞体外杀伤B16F10黑色素瘤细胞的影响

发布时间：2017-12-09 17:31

  本文关键词：Cbl-b基因沉默对TRP-2肽疫苗免疫小鼠淋巴细胞体外杀伤B16F10黑色素瘤细胞的影响

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【摘要】：恶性黑素瘤是恶性程度最高的皮肤肿瘤,临床上迫切需要新型的治疗策略。治疗性疫苗是一种极具发展前景的生物治疗方法,但目前临床有效率仍较低。近年来研究发现泛素连接酶Cbl-b是调节T细胞活化的关键分子,直接参与了T细胞的活化及免疫耐受过程,在避免免疫无能、维持外周T细胞耐受力方面具有重要作用。本文首先构建Cbl-b基因特异性siRNA和shRNA真核表达载体,筛选siRNA高效转染的方法,转染经肽疫苗体内免疫过的小鼠原代淋巴细胞,诱导淋巴细胞Cbl-b基因沉默,进而检测小鼠原代淋巴细胞体外免疫活性状态及细胞因子分泌情况的改变,并探讨肽疫苗免疫淋巴细胞和B16F10黑素瘤细胞系体外共培养时,Cbl-b沉默对淋巴细胞杀伤肿瘤细胞作用的影响。第一部分：Cbl-b基因ShRNA干扰载体的构建及效果评价目的：构建小鼠Cbl-b基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒,并初步鉴定其干扰效果,为后续研究奠定基础。方法：根据GenBank提供的Cbl-b cDNA序列,设计并合成4对短发夹结构的互补DNA序列,克隆至载体PGPU6/GFP/Neo构建重组质粒,并予以DNA测序鉴定。重组干扰质粒构建成功后,将干扰质粒与Cbl-b过表达载体共转染293T细胞,于转染后48h通过实时荧光定量PCR法及蛋白质印记法检测各质粒对Cbl-b基因的表达抑制效应。结果：测序分析证实四对shRNA寡核苷酸序列分别成功插入至shRNA真核表达载体PGPU6/GFP/Neo中,将构建成功的PGPU6/GFP/Neo-shRNA质粒与Cbl-b的真核表达载体共转染细胞48h后,通过荧光实时定量PCR法及western blotting发现四条shRNA序列对Cbl-b的表达均有一定的抑制效应,其中以1号shRNA序列对Cbl-b表达的抑制程度最高(p0.05)。结论：成功构建并筛选出沉默效应最高的Cbl-b shRNA真核细胞表达载体,为进一步研究Cbl-b沉默后作用奠定了基础。第二部分：小鼠原代淋巴细胞转染方式选择目的：探讨小鼠原代淋巴细胞siRNA转染的有效方法。方法：从小鼠脾脏和淋巴结分离原代淋巴细胞,优化培养体系,采用siRNA+Lipofectamine 2000、慢病毒载体+polybrane、慢病毒载体+EnvirusTM-LV及siRNA+EntransterTN-R四种方式转染小鼠淋巴细胞,通过荧光显微镜观察及流式细胞术检测进行转染效率评价。结果：采用上述4种转染放方法介导转染小鼠原代淋巴细胞,慢病毒+polybrane转染后96小时荧光显微镜下只可见稀疏荧光信号,转染效率低于5‰脂质体、慢病毒+EnvirusTN-LV几乎未见明显荧光信号,而采用siRNA+EntransterTN-R转染24 h后荧光显微镜下荧光信号明显强于前三者,采用EntransterTM-R转染100及50nmol/L siRNA,24 h后转染效率分别为43.1%和22.8%；结论：siRNA+ EntransterTM-R4000可有效转染小鼠原代淋巴细胞。第三部分：Cbl-b基因沉默联合肽疫苗对小鼠原代淋巴细胞体外杀伤B16F10黑素瘤细胞作用的影响目的；观察Cbl-b基因特异性小干扰RNA(siRNA)沉默Cbl-b基因对于小鼠原代淋巴细胞免疫活性影响。方法：用SVY肽疫苗体内免疫C57BL/6小鼠,取脾和淋巴结梯度离心分离淋巴细胞,体外用SVY肽和IL-2刺激淋巴细胞增殖,应用EntransterTM-R4000将Cbl-b基因特异性SiRNA转染小鼠原代淋巴细胞,转染48 h后细胞计数试剂盒(CCK-8)试剂盒检测淋巴细胞增殖程度,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测上清中INF-γ及TNF-α的分泌量；CCK8法检测混合培养体系中淋巴细胞对B16F10黑素瘤细胞的杀伤活性。结果：特异性Cbl-b siRNA能有效沉默淋巴细胞Cbl-b基因；转染48 h后,CCK-8试剂盒检测Cbl-b siRNA转染组、NC转染组的吸光度值分别为1.246±0.063和0.906±0.039,差异有统计学意义；转染后淋巴细胞培养液中INF-γ分泌量,转染组为95.80±17.85,转染阴性对照组为49.92±9.89,差异有统计学意义；转染后淋巴细胞培养液中TNF-α的分泌量转染组为62.23±4.409,显著高于转染阴性对照组32.29±2.099,差异有统计学意义；淋巴细胞杀伤活性检测结果显示转染组杀伤活性明显高于转染阴性对照组。结论：利用特异性siRNA沉默Cbl-b基因能够增强小鼠原代淋巴细胞的增殖能力及免疫活性,在体外可增强淋巴细胞对黑素瘤细胞的杀伤活性。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.5

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本文编号：1271266