结合fH对淋病候选疫苗NspA免疫活性的影响

发布时间：2017-12-13 17:25

  本文关键词：结合fH对淋病候选疫苗NspA免疫活性的影响

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【摘要】：淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)引起的淋病是最常见的性病之一,对人类健康造成极大危害。淋病奈瑟菌可重复感染,并大大增加HIV的感染机会。耐药菌株的不断出现使淋病的治疗面临很大困境。因此,研制有效疫苗成为淋病防治的一个研究热点。 本实验室前期研究提示表面蛋白A(Neisseria surface protein A,NspA)在小鼠体内诱导产生具有淋病奈瑟菌特异性杀菌作用的抗体,可作为一种淋病候选疫苗。脑膜炎奈瑟菌NspA可结合人补体调控蛋白H因子(factor H, fH),而脑膜炎奈瑟菌强力候选疫苗H因子结合蛋白(factor H-binding protein, fHBP)结合fH后降低了免疫原性及其诱生抗体的杀菌作用。考虑到淋病奈瑟菌与脑膜炎奈瑟菌的NspA有95%的同源性,我们认为淋病奈瑟菌NspA也可能结合fH。为研究淋病奈瑟菌NspA与fH的结合性以及结合fH对NspA的免疫原性和抗体保护性的影响,本文进行了以下研究。 1. fHSCR5-8的原核表达及其多克隆抗体的制备 fH与NspA的结合位点位于SCR(short consensus repeat)6-7,因此,本研究根据发表的fHcDNA序列设计了正反向引物,以Dan M. Granoff教授馈赠的pCAGGS-fH质粒为模板用PCR技术克隆了fH SCR5-8的编码基因,并构建了重组原核表达载体pCold-fHSCR5-8。序列分析结果表明克隆的fH SCR5-8编码基因与GeneBank发表的相应序列同源性为100%。在BL21(DE3)中经IPTG诱导表达了76kDa的His-TF-fH SCR5-8融合蛋白。重组蛋白经Bio-Rad蛋白纯化仪纯化后纯度为93%。用pCAGGS-fH真核表达载体免疫小鼠,制备了fH多克隆抗体,ELISA检测表明抗体的效价在1：6400-1：12800之间。Western-blotting结果表明rfH SCR5-8能与基因免疫抗体结合,具有良好的抗原性。 2.NspA的原核表达及淋病奈瑟菌WHO-A株多克隆抗体的制备 为研究NspA能否与fH结合,以含pVAX1-NspA的重组菌为模板,用PCR技术克隆了NspA的编码基因,与pCold-TF载体连接后,构建了NspA原核表达载体pCold-NspA,转化BL21(DE3)后经IPTG诱导表达了68kDa的His-TF-NspA融合蛋白。用Bio-Rad蛋白纯化仪纯化的重组蛋白纯度为95%。为制备可结合NspA的抗体,用淋病奈瑟菌WHO-A株免疫小鼠,ELISA检测表明免疫血清的效价在1：1600-1：3200之间。Western-blotting分析表明rNspA能与WHOA株多克隆抗体结合。 3.淋病奈瑟菌NspA与fH SCR5-8的结合性分析 淋病奈瑟菌WHO-A株与rfH SCR5-8及fH基因免疫血清孵育后用流式细胞仪检测,结果表明WHO-A株能与rfH SCR5-8结合,提示WHO-A株表面有一种或多种物质可结合rfH SCR5-8。将rNspA转印PVDF膜,与rfH SCR5-8及fH基因免疫血清孵育后在68kDa左右处检测到明显反应条带,提示rNspA可与fH SCR5-8结合。在96孔板中包被rNspA, ELISA检测也提示了rNspA与rfH SCR5-8的结合。 将fH SCR5-8编码基因插入pEGFP-N1真核表达载体,获得的重组载体pEGFP-fHSCR5-8转染CT-26细胞,G418筛选后获得稳定表达重组蛋白的转染细胞。提取重组细胞的总蛋白,转印PVDF膜,与rNspA及WHO-A抗体孵育后在76kDa处可检测到明显反应条带,验证了fH SCR5-8与NspA的结合。 4.结合fH对NspA候选疫苗免疫效应的影响 为研究结合fH后对NspA候选疫苗免疫效应的影响,将rNspA和rNspA-rfH的复合体分别免疫小鼠,ELISA检测表明rNspA免疫组抗体效价与rNspA-rfH SCR5-8复合体免疫组的抗体效价无明显差异,抗体与淋病奈瑟菌的结合能力降低。抗体介导补体杀菌实验结果表明,rNspA-rfH SCR5-8复合体免疫组杀菌活性降低。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R759.2;R392

【参考文献】

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本文编号：1285973