组蛋白低乙酰化下调PIB5PA表达在人黑色素瘤发生和发展中的作用及其分子机制

发布时间：2017-12-14 08:28

  本文关键词：组蛋白低乙酰化下调PIB5PA表达在人黑色素瘤发生和发展中的作用及其分子机制

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【摘要】：研究背景及目的黑色素瘤是来源于神经嵴黑色素细胞的一种最致命的皮肤恶性肿瘤。由于其恶性程度极高，且易于早期转移，患者临床发现时已丧失手术治疗的机会，而且放化疗效果普遍不佳，导致其治疗难度大。因此，深入了解黑色素瘤的发病机理和耐药机制，以寻求针对特异性分子靶点的个体化治疗成为目前黑色素瘤治疗的热点。目前研究发现PI3K/Akt信号通路在70%黑色素瘤中被高度激活，这可能导致了黑色素瘤对化疗和一些分子靶向治疗如BRAFV600E抑制剂的抵抗。而对于能够负向调控该信号通路的多磷酸肌醇-3-磷酸酶PTEN的缺失正是导致PI3K/Akt信号通路在黑色素瘤中高活化的重要原因之一。然而对于与PTEN类似的具有脂质磷酸酶活性的多磷酸肌醇-5-磷酸酶在黑色素瘤发生和发展中的作用尚无相关研究报道。本研究旨在通过鉴定一种多磷酸肌醇-5-磷酸酶分子-PIB5PA在黑色素瘤发生和发展中的作用并阐明其负向调控PI3K/Akt信号的分子机制，为黑色素瘤的个体化治疗提供一个新的分子靶点，另外通过对PIB5PA在黑色素瘤细胞中下调表达的表观遗传调控机制的探索，不仅为研究黑色素瘤的发生发展机制提供新的思路，同时对下调PIB5PA表达的HDAC的鉴定将有益于发展更特异的HDAC抑制剂抑制黑色素瘤的生长。 方法（1）分别采用免疫组化法、Western blot以及实时定量PCR检测黑色素瘤组织芯片、新鲜黑色素瘤原代培养细胞以及黑色素瘤细胞系中PIB5PA, PTEN以及磷酸化Akt的表达水平。（2）选择两株极低表达PIB5PA以及Akt高活化的黑色素瘤细胞系ME1007和Mel-FH瞬时转染PIB5PA cDNA以及建立携带可诱导表达PIB5PA基因系统的黑色素瘤亚细胞系（ME1007.PIB5PA和Mel-FH.PIB5PA），采用Western blot检测PIB5PA和磷酸化Akt的表达，BrdU细胞增殖试验和克隆形成试验检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡；通过在正常人黑色素细胞中knockdown PIB5PA以及PTEN，利用软琼脂克隆试验检测黑色素细胞非贴附性生长情况；通过建立ME1007.PIB5PA细胞的裸鼠荷瘤模型，观察4-OHT诱导PIB5PA表达对体内黑色素瘤生长的影响，明确PIB5PA在黑色素瘤生长中的作用；在此基础上，通过对过表达或knockdown PIB5PA的细胞同时转染myr-Akt或Akt shRNA，检测其对PIB5PA抑制细胞增殖和肿瘤生长的逆转效果，明确PIB5PA抑制黑色素瘤生长的分子机制。（3）通过对PIB5PA和PTEN基因的单独或双重转染，在血清饥饿状态下加以EGF诱导，利用Western blot检测黑色素瘤细胞中Akt活化水平的改变，以及同时沉默PIB5PA和PTEN基因，利用软琼脂克隆试验检测正常黑色素细胞的生长情况，以了解PIB5PA和PTEN在调节黑色素瘤细胞PI3K/Akt通路中的作用关系。（4）通过对10株黑色素瘤细胞系PIB5PA基因外显子的测序，实时定量PCR对黑色素瘤细胞PIB5PA基因拷贝数进行分析，Western blot和实时定量PCR检测DNA甲基化抑制剂5-aza以及不同特异性的HDAC抑制剂分别作用黑色素瘤细胞前后PIB5PA的表达水平，初步明确PIB5PA在黑色素瘤下调表达的原因；通过对特异性HDAC的siRNA knockdown，，利用western blot检测PIB5PA表达水平的变化确定黑色素瘤细胞中下调PIB5PA表达的HDAC；通过对PIB5PA基因启动子区进行递增式删除构建荧光素酶报告基因系统，利用双荧光素酶报告基因检测和染色质免疫沉淀试验明确HDAC通过SP1结合于PIB5PA启动子区从而影响PIB5PA转录表达的分子机制。 结果（1）与正常痣组织和黑色素细胞相比，在黑色素瘤病理组织以及黑色素瘤细胞中PIB5PA的表达是明显降低或缺失的，且与PTEN的表达呈一定的正关联。（2）在黑色素瘤细胞中过表达PIB5PA能降低Akt的活化，抑制黑色素瘤细胞的增殖，而共转染myr-Akt能逆转其抑制作用；在正常黑色素细胞中knockdownPIB5PA能抑制Akt的活化，促进黑色素细胞的非贴附性生长，而共转染Akt shRNA却能逆转其促进作用；外源性诱导PIB5PA在裸鼠荷瘤试验中抑制肿瘤的生长，而对ME1007.PIB5PA细胞感染myr-Akt慢病毒颗粒后能逆转PIB5PA对肿瘤生长的抑制作用。（3）撤除血清后，过表达PIB5PA能在EGF刺激下引起Akt磷酸化水平的一过性增高，而过表达PTEN仅显示磷酸化Akt的整体水平的降低；在EGF刺激下，对黑色素瘤细胞同时过表达PIB5PA和PTEN能进一步降低Akt的活化水平，而同时在两株相对高表达PIB5PA的黑色素瘤细胞中同时knockdown PIB5PA和PTEN则引起Akt的进一步激活；相对于在正常黑色素细胞中仅knockdownPIB5PA或PTEN，双重knockdown PIB5PA和PTEN形成的细胞克隆的体积明显增大，而细胞克隆数却有所减少。（4）尽管基因拷贝数降低可能造成一部分黑色素瘤细胞（20%）中PIB5PA的低表达，但是由HDAC2和-3引起的组蛋白低乙酰化是造成黑色素瘤细胞中PIB5PA下调表达的一个重要因素。HDAC2和-3能通过结合转录因子SP1作用于PIB5PA启动子区（-516/-116）进而抑制PIB5PA的转录表达。 结论PIB5PA的下调表达所引起的黑色素瘤中PI3K/Akt信号通路被激活，以及与PTEN的协同作用，可能是造成黑色素瘤发生发展以及对化疗产生抵抗的一个重要因素。组蛋白低乙酰化抑制了PIB5PA在黑色素瘤细胞中的表达，其主要机制在于HDAC2和-3与转录因子Sp1形成转录抑制复合体结合于PIB5PA启动子参与了对PIB5PA基因转录活性的负向调节。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.5

【共引文献】

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本文编号：1287226