人表皮和毛囊的细胞培养及黑素细胞重编程的研究

发布时间：2017-12-21 23:39

  本文关键词：人表皮和毛囊的细胞培养及黑素细胞重编程的研究　出处：《蚌埠医学院》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的:(1)观察表皮细胞在三种培养基中的生长状况,检测不同时间点培养上清中内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)和干细胞因子(Stem cell factor,SCF)的水平;(2)连续观察成人头皮毛囊外根鞘(Outer root sheath,ORS)和毛乳头(Dermal papilla,DP)细胞的生长及形态学变化;(3)采用3个因子转染人表皮黑素细胞(melanocytes,MCs)成为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)。方法:(1)采用3种培养基培养表皮细胞,分别在培养24h、48h、72h、96h时收集培养上清,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测ET-1和SCF水平,同时比较不同培养基中细胞的生长状态;(2)利用两步酶消化获得正常人头皮毛囊的ORS和DP,采用添加人角质形成细胞生长添加物(human keratinocyte growth supplement,HKGS)和人黑素细胞生长添加物(human melanocyte growth supplement,HMGS)的K-SFM进行体外培养,倒置显微镜下连续观察毛囊ORS和DP的迁移和生长;(3)用分别携带Oct4、Klf-4和c-Myc因子的慢病毒载体转染人表皮MCs,对生成的克隆进行碱性磷酸酶染色(AP)、甲基化水平检测、干细胞标记相关抗体的免疫荧光染色、透射电镜观察超微结构、体外诱导三胚层分化。结果(1)三组培养上清中,培养基2(M2)中上清ET-1的含量最高;随着时间延长ET-1含量均增加,三组间比较差异有统计学意义(P0.01);三组培养上清中SCF含量在第24~48小时含量显著下降,三者之间的差异有统计学意义(P0.01)。换液后ET-1和SCF变化趋势基本同换液前(P0.01)。M2中细胞增殖最快,角质形成细胞(keraticytes,KCs)呈集落样生长,MC的树突较多。培养基1(M1)中贴壁细胞数目少,死亡细胞多,细胞增殖缓慢,KCs散在,MCs多是双极。培养基3(M3)细胞生长情况介于M1和M2两组之间;(2)将单个毛囊置于预先涂布血清的培养板2小时,然后添加少量培养基,毛囊粘附于培养板的几率增加,数小时后,即可见细胞从ORS及DP处迁移生长,以KCs、成纤维细胞(fibroblasts,FBs)为主,MCs较少。并且,ORS和DP的迁出和生长有明显不同。如果培养基过多,则多数毛囊悬浮,无细胞迁出,最终死亡。(3)采用携带Oct4、Klf-4和c-Myc因子的3个慢病毒载体转染人表皮MCs,转染后第6天,开始形成克隆。第1代和第3代i PSCs的AP染色为阳性;与母本相比,Oct4和Nanog基因位点部分去甲基化,透射电镜观察可见细胞增生活跃,部分细胞中有3个核仁,极少数细胞的细胞浆中可见散在I和II期黑素体。将第5代i PSCs悬浮培养获得拟胚体,后者贴壁培养后,干细胞相关抗体染色显示Sox2阳性、Cdy1强阳性。用第5代克隆进行诱导分化,在分化后2周,显示代表脂肪细胞的油红染色阳性,代表肝细胞的白蛋白染色阳性,但代表神经元标记的相关染色阴性。结论:(1)培养基中高水平ET-1有利于表皮细胞的贴壁、增殖和分化。在培养过程中表皮细胞能够分泌ET-1,并释放入培养上清。表皮细胞培养消耗SCF,但无明显表皮分泌作用。(2)预先涂布血清和开始仅添加少量培养基,有利于毛囊粘附,随后细胞迁移生长。(3)携带3个因子的慢病毒转染人表皮MCs,可以产生不完全型的i PSCs,表达大部分干细胞的性能,体外也能诱导成脂肪细胞、肝脏细胞,但没有成功诱导成神经元细胞。
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R758.7

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本文编号：1317614