伊曲康唑和薏苡仁油对小鼠黑色素瘤B16细胞株的影响

发布时间：2018-02-05 02:43

本文关键词： 黑色素瘤伊曲康唑薏苡仁油 B16细胞周期 VEGF　出处：《河北医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:黑色素瘤为皮肤及黏膜常见的侵袭性肿瘤,在过去的几十年间,其发病率和死亡率在逐年上升,如何能更好的控制其病情的发展和延长患者生存期,已经成为临床医生面临的主要问题。伊曲康唑为临床常用的一线三唑类抗真菌药物,广泛应用于各种浅部和深部真菌感染,伊曲康唑注射液还应用于系统性真菌感染。近年来W shi等学者发现,伊曲康唑具有抑制肿瘤血管内皮细胞增殖的作用[1],Inoue K等通过研究发现伊曲康唑显著抑制子宫内膜癌细胞的增殖和迁移[2]。Lockhart NR发现在用伊曲康唑治疗一位胰腺癌晚期患者合并的真菌感染时,原本失去手术机会的这位患者在接受了9个月的治疗后,病情得到控制,肿瘤缩小,重新获得了手术切除肿瘤的机会。在whipple手术后几年时间随访中未发现复发和转移[3]。伊曲康唑的这种抗肿瘤作用已经为越来越多的医务工作者所认识。薏苡仁油为禾本科植物薏苡种仁中提取的一种活性物质,其主要活性成份为脂肪酸及脂类,其中抗肿瘤成份为甘油三酯类。P Pei等发现薏苡仁油(康莱特)在lewis肺癌的治疗过程中表现出强有力的抗肿瘤及免疫刺激活性[4]。Lu X等学者报道通过基础实验发现薏苡仁提取物对肺癌A549细胞增殖有明显的抑制作用,且可以诱导A549细胞的凋亡[5]。本文将通过实验观察伊曲康唑及薏苡仁油对小鼠黑色素瘤B16细胞株的影响及部分作用机制。方法:1细胞培养2四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法绘制小鼠B16细胞的生长曲线,完成对其生长特征观察。3运用MTT法检测两种药物在不同浓度及作用时间下对小鼠B16细胞的影响。4倒置显微镜下和HE染色法观察B16细胞在药物作用前后细胞形态变化。5运用流式细胞技术(FCM)检测药物干预后B16细胞周期变化及凋亡情况。6运用细胞免疫组化技术检测细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达情况。7应用SPSS21.0进行统计学分析。结果:1MTT法绘制B16细胞生长曲细胞在96孔板中培养不同时间后,用酶标仪测OD值,绘制成的生长曲线近“S”型。2MTT法检测药物干预作用结果MTT结果经统计学分析表明,伊曲康唑组随药物浓度增大,作用时间的延长,对B16细胞的抑制作用越强(P0.05)。薏苡仁油组随药物浓度增大,作用时间的延长,对B16细胞的抑制作用越强(P0.05)。两实验组比较,两药物作用24小时后,1.41μg/ml的伊曲康唑与20μl/ml的薏苡仁油,2.82μg/ml的伊曲康唑与40μl/ml的薏苡仁油,5.65μg/ml的伊曲康唑与80μl/ml的薏苡仁油,11.30μg/ml的伊曲康唑与160μl/ml的薏苡仁油抑制率比较后差异均有统计学意义(P0.05)。两药物作用48小时后,1.41μg/ml的伊曲康唑与20μl/ml的薏苡仁油抑制率比较无统计学意义(P0.05)。其余组间比较均有统计学差异(P0.05)。两药物作用72小时后,各浓度伊曲康唑与薏苡仁油组间比较差异均有统计学差异(P0.05),其中浓度为11.30μg/ml的伊曲康唑对小鼠B16细胞的抑制作用最大。3倒置显微镜下细胞形态特征和培养基颜色观察肉眼观察培基颜色变化:伊曲康唑组随着作用时间的延长,培基颜色由最初的淡黄逐渐变化为深红色,且浓度越大作用时间越长,颜色深度变化程度越明显。薏苡仁油组培基颜色变化不太明显。倒置显微镜下形态变化:对照组B16细胞生长状态良好,细胞呈多角形或菱形,细胞连接紧密,贴壁均匀生长,胞膜完整,胞浆透亮,可见胞核。药物作用后,镜下可见细胞数量减少,细胞变圆,体积变小,伪足减少甚至消失,细胞变得皱缩漂浮,可见细胞碎屑,部分成团,胞浆不均匀。相对于薏苡仁油组,伊曲康唑组的变化更为明显。4 HE染色观察B16细胞形态学特细胞经HE染色,胞核呈蓝色,胞质染色均匀呈粉红色,部分细胞可见多核及核分裂像,胞膜完整,形态规则,细胞间连接紧密。药物干预后细胞贴壁数目减少,形态变圆,体积缩小,部分脱落,胞质浓缩边缘化,与倒置显微镜下直接观察相比,染色后细胞形态变化更加直观、清晰。两实验组比较,伊曲康唑组较薏苡仁油组对细胞形态影响更为显著。5药物对B16细胞的细胞周期及凋亡的影响药物对细胞周期的影响:两种药物与对照组对比可发现,随着药物浓度的增高,G0/G1期的细胞比例逐渐增加,S期比例逐渐减小且均具有统计学意义(P0.05)。药物对细胞凋亡的影响:药物作用24小时后,DNA直方图并未发现明显的细胞凋亡峰。6药物对B16细胞VEGF蛋白表达影响免疫组化法检测VEGF蛋白表达发现,与对照组比较,两种药物作用后VEGF蛋白量表达均下降(P0.05)伊曲康唑组:随着药物浓度的增加VEGF表达量下降,具有统计学意义(P0.05)。薏苡仁油组:随着药物浓度的增加VEGF表达量下降,具有统计学意义(P0.05)。两实验组比较,伊曲康唑组VEGF蛋白表达量下降更为明显。结论:1伊曲康唑和薏苡仁油均对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖有一定的抑制作用,在一定范围内,抑制作用随药物浓度加大及作用时间的延长逐渐增强。2伊曲康唑和薏苡仁油均对小鼠黑色素瘤B16细胞VEGF蛋白表达有抑制作用并呈浓度依赖,且伊曲康唑的抑制作用强于薏苡仁油。由此可见,抑制VEGF蛋白表达可能是两种药物抗B16细胞增殖的原因之一。3伊曲康唑和薏苡仁油均可以将小鼠黑色素瘤B16细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期。本实验未检测到明显凋亡峰,可能原因为本实验细胞凋亡的发生处于早期阶段,细胞凋亡峰不明显,两种药物通过影响细胞凋亡机制来抑制其增殖的作用还有待进一步实验证实。4伊曲康唑对小鼠黑色素瘤细胞增殖的抑制作用强于薏苡仁油。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.5

【参考文献】